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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌落PCR无条带
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笔冰河

银虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR无条带

双酶切T载体和表达载体后，回收获得目的片段和载体，连接，转化，挑18个单克隆，菌落PCR全部无条带，这是怎么回事，目的片段确定酶切成功，表达载体无法从电泳图上确定是否两个位点都酶切成功（两个酶切位点紧连着）。可能是什么原因呢？
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1楼 2011-12-19 19:02:26
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笔冰河

银虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 我也觉得~ 2011-12-27 17:25:42
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楼: Originally posted by xhy0016 at 2011-12-19 19:09:00:
你为什么不提质粒跑电泳验证一下，而非要直接菌落PCR呢

一般不是都先菌落PCR吗，几十个菌落，提质粒成本太高了，而且还需要过夜摇菌
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3楼2011-12-20 08:35:06
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笔冰河

银虫 (小有名气)
降低了退火温度，增加了5个循环，重新挑12个单克隆，全部都有条带，但是很淡，是不是假阳性的概率比较高啊
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7楼2011-12-20 18:59:32
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笔冰河

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
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楼: Originally posted by panda73 at 2011-12-20 21:41:26:
载体的处理很重要，你如果不确定载体是否处理完全，可以在做双酶切时，设置类似的单酶切对照，根据质粒带型的变化确定是否在双酶切体系中，两个酶都正常工作了。另外，双酶切时，加的酶量很重要，多了容易star ac ...

谢谢！
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10楼2011-12-21 19:38:38
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笔冰河

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by zhengli123 at 2011-12-22 20:51:07:
太多的假阳性菌落，很可能就是载体没切完全

我也觉得，挑了二三十个单克隆，总算是有一个阳性的了
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12楼2011-12-23 09:54:09
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笔冰河

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by lilihuang1125 at 2011-12-23 11:25:40:
如果你的目的片段和载体的酶切是同时进行的话，目的片段切的很好，载体应该也切得没问题了。
以我的经验，如果菌落PCR有很亮的条带，最后提质粒酶切鉴定一般都是阳性的，你的条带很弱，基本就是假阳性，建议试试 ...

谢谢
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14楼2011-12-26 13:38:10
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