| 查看: 3977 | 回复: 26 | ||||
johnny4890新虫 (小有名气)
|
[求助]
提取RNA与做RT-PCR的问题
|
最近从霉菌中提取总rna，质量不好，反转录老是做不出来，而且pcr的时候经常把水那组p出条带来==。请大家给我点意见。先看看我的总rna电泳图。 （第一次） （第二次）所用的protocol是网上下载的山寨版本。如下： RNA的提取 准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制) 操作步骤: 1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。 b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。 c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。 2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。 5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。 6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。 7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。 8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。 9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。 10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生物 | 分子生物学资料 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有89人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 请教RNA提取高手：反转录PCR（RT-PCR)中DNA的去除
已经有18人回复
- RNA 提取的一些问题，请大家帮忙回答
已经有13人回复
- 有关提取全血DNA和RNA问题。
已经有4人回复
- RNA浓度好低 适合做RT-PCR吗？
已经有7人回复
- 关于RNA提取过程中的问题
已经有3人回复
- 关于RNA提取的问题
已经有8人回复
- 拟南芥RNA提取问题
已经有13人回复
- 【求助/交流】细菌总RNA的提取和RT-PCR
已经有8人回复
- 【求助/交流】水稻叶片RNA提取问题
已经有15人回复
- 【求助/交流】求助高手-棉花中RNA提取质量验证及反转后cDNA质量验证问题
已经有13人回复
- 【求助/交流】RNA的提取问题和qRT-PCR分析基因在不同时间的定量表达
已经有10人回复
- 谁做过双链RNA的RT-PCR
已经有4人回复
atlanticwi
金虫 (正式写手)
琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
- MolEPI: 25
- 应助: 138 (高中生)
- 金币: 141.2
- 散金: 350
- 红花: 13
- 帖子: 536
- 在线: 313.2小时
- 虫号: 1099992
- 注册: 2010-09-15
- 专业: 植物生理与生化
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 呵呵，欢迎交流 2012-05-02 13:38:59
johnny4890: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-02 21:38:16
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 呵呵，欢迎交流 2012-05-02 13:38:59
johnny4890: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-02 21:38:16
|
嗯................ 我觉得，这样的RNA肯定是不能用的，电泳结果显示出你的RNA降解的比较严重，同样有Smear的话，基因组DNA还是有污染的，网上的这个Protocol我看基本的操作没有问题，主要是TRIzol试剂你是怎么配的呢，还是买的商业化TRIzol？同样具体应用到你菌的RNA提取上，不知道这个Protocol是否适用............. 个人看法 若有说错请高手指点  |
2楼2012-04-30 20:38:11
johnny4890
新虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 160.9
- 散金: 254
- 红花: 1
- 帖子: 260
- 在线: 106.8小时
- 虫号: 1453168
- 注册: 2011-10-20
- 专业: 微生物生理与生物化学
3楼2012-04-30 20:47:45
atlanticwi
金虫 (正式写手)
琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
- MolEPI: 25
- 应助: 138 (高中生)
- 金币: 141.2
- 散金: 350
- 红花: 13
- 帖子: 536
- 在线: 313.2小时
- 虫号: 1099992
- 注册: 2010-09-15
- 专业: 植物生理与生化
4楼2012-04-30 20:49:31
johnny4890
新虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 160.9
- 散金: 254
- 红花: 1
- 帖子: 260
- 在线: 106.8小时
- 虫号: 1453168
- 注册: 2011-10-20
- 专业: 微生物生理与生物化学
5楼2012-04-30 21:23:02
weng1988
铜虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 173.4
- 散金: 50
- 帖子: 208
- 在线: 16.1小时
- 虫号: 1171207
- 注册: 2010-12-16
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
6楼2012-05-01 14:44:26
trizol11
木虫 (正式写手)
- 应助: 47 (小学生)
- 金币: 2714.2
- 散金: 199
- 红花: 3
- 帖子: 572
- 在线: 172.8小时
- 虫号: 1711824
- 注册: 2012-03-23
- 性别: GG
- 专业: 兽医药理学与毒理学
7楼2012-05-02 10:36:25
chenguestc
木虫 (职业作家)
- MolEPI: 7
- 应助: 576 (博士)
- 贵宾: 0.4
- 金币: 4526.9
- 散金: 1639
- 红花: 176
- 帖子: 4708
- 在线: 353.5小时
- 虫号: 1337860
- 注册: 2011-07-05
- 性别: GG
- 专业: 作物分子育种
8楼2012-05-02 11:05:25
Pushing2012
金虫 (正式写手)
- 应助: 13 (小学生)
- 金币: 1679.8
- 散金: 10
- 红花: 1
- 帖子: 855
- 在线: 121.8小时
- 虫号: 1672843
- 注册: 2012-03-07
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
9楼2012-05-02 11:12:28
johnny4890
新虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 160.9
- 散金: 254
- 红花: 1
- 帖子: 260
- 在线: 106.8小时
- 虫号: 1453168
- 注册: 2011-10-20
- 专业: 微生物生理与生物化学
10楼2012-05-02 13:49:56
50