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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 可变剪切体RT-PCR检测的技术问题
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章信来

木虫 (正式写手)

[求助] 可变剪切体RT-PCR检测的技术问题

各位虫友：
我有个基因存在不止一种类型可变剪切情况，当共同点是基因中间片段缺失，我想设计两端保守位的引物，采用RT-PCR的方法检测不同组织间的分布规律，如果都存在的话会同时扩增出几条大小不等的目的条带，RT-PCR结果则完全不是那么回事，所有组织只能扩增出一条最小的可变剪切体，其他的，尤其是未发生可变剪切的原始基因都扩增不出来，请各位虫友帮忙分析下原因和解决办法（PCR条件优化很多次了，不见任何改观），谢谢各位！
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1楼 2012-11-23 08:09:49
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章信来

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cnb1987 at 2013-04-02 16:19:22
你好，我想问问，对于基因的不同剪切体如何鉴定？

你是说如何确定一个基因是否存在可变剪切体对吧？
我的情况是用基因两端特异性引物做RT-PCR，电泳结果发现几条较为特异的目的片段，就克隆测序回来发现是基因mRNA中间出现缺失造成的，缺失的两端序列符合可变剪切的AT-AG原则（好像是AT-AG），所以基本上判断为AS，查阅相关文献发现哺乳动物基因可变剪切事件稀松平常，貌似超过75%以上的基因能进行AS。
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5楼2013-04-03 19:27:12
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cnb1987

银虫 (小有名气)
你好，我想问问，对于基因的不同剪切体如何鉴定？
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2楼2013-04-02 16:19:22
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robustli

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

How do you optimize your PCR condition? I have met the same thing. I use KOD to amplify my target gene. I only got the small fragment. Later I increased the denature and primer annealing time (from 20s to 25s). Interestingly, the bigger band appeared.
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immunologyparasite
3楼2013-04-02 21:11:06
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章信来

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by robustli at 2013-04-02 21:11:06
How do you optimize your PCR condition? I have met the same thing. I use KOD to amplify my target gene. I only got the small fragment. Later I increased the denature and primer annealing time (from 2 ...

in fact, i haven't  solve this question yet, i want to do northern-blot, your suggestion maybe work, i will try it, thanks!
the big problem of AS is how to study the function, especially the different function to wild type gene, do you have any good idea?
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4楼2013-04-03 19:19:38
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