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xuzhu598

铁虫 (小有名气)

[求助] 求助!关于RT-PCR的问题!

最近在做关于反转录PCR,想请教几个问题:
1.如何确定RNA反转录是否成功?(是否可以跑下琼脂糖电泳)
2.我反转录之后的PCR中,电泳结果什么也没有,就连内参引物也没有扩出来,不知是什么原因?
我反转录用的是takara的PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit,之后的PCR用的是Pyrobest® DNA Polymerase!
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-11-07 18:44:53:
确定反转录是否成功,一般就是扩增内参基因了,内参扩增出来就是有问题的。当然,如果怀疑PCR,也可以换一对引物来扩增内参,不过内参扩不出来,个人认为反转录就是失败了。

“内参扩增出来就是有问题的”???这是什么意思啊,应该是内参扩增出来就证明反转录成功了吧!
5楼2011-11-07 18:54:10
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guifang

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励积极应助! 2011-11-07 20:07:25
反转录完了之后,你可以跑个电泳,点上Marker,然后电泳,对照Marker上的,用凝胶分析系统分析就知道反转录的DNA是多大的了,如果跟你的目的基因基本一致,就证明反转录成功。
电泳结果没有,内参也没出来,你可以尝试电泳时间加长,或者加大电泳电压,再出不来的话,估计引物问题了。
2楼2011-11-07 17:38:43
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+5): 鼓励积极应助! 2011-11-07 20:07:32
引用回帖:
2楼: Originally posted by guifang at 2011-11-07 17:38:43:
反转录完了之后,你可以跑个电泳,点上Marker,然后电泳,对照Marker上的,用凝胶分析系统分析就知道反转录的DNA是多大的了,如果跟你的目的基因基本一致,就证明反转录成功。
电泳结果没有,内参也没出来,你可 ...

个人表示不同意。
反转录酶很贵,cDNA跑胶跑胶很浪费啊。而且反转录产物量很少,直接跑胶看不到东西的。如果楼主不是用的基因特异性引物,而是用的Oligo dT或者随机引物,得到的是总的cDNA,跑胶根本一点意义都没有。

PCR没有结果,改变电泳时间跟电压是没用的。有产物的话,总会看到条带的。
3楼2011-11-07 18:43:17
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

确定反转录是否成功,一般就是扩增内参基因了,内参扩增不出来就是有问题的。当然,如果怀疑PCR,也可以换一对引物来扩增内参,不过内参扩不出来,个人认为反转录就是失败了。

[ Last edited by 西瓜 on 2011-11-7 at 20:33 ]
4楼2011-11-07 18:44:53
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