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向RTPCR高手求助，关于RTPCR的空白对照问题
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| 各位虫友大家好，我最近初做RTPCR，想请教一下高手是不是用于RTPCR的每对引物使用前都得进行模板为水的空白对照实验，以确定后期熔解曲线的峰是不是出现了特异性扩增，望高手解答，谢谢！！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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西瓜
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
yuyan225(金币+7): 谢谢指教，收教了 2011-06-19 11:25:41
dhd997(金币+5): good 2011-06-25 13:34:58
yuyan225(金币+7): 谢谢指教，收教了 2011-06-19 11:25:41
dhd997(金币+5): good 2011-06-25 13:34:58
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看空白对照是一个办法，不过就算加利模板，在融解曲线里也是可以看出引物二聚体的峰的。就算大小差不多，引物二聚体的结合强度肯定不及PCR产物，Tm值要低些，跟产物相比，出现峰的位置肯定在温度更低的地方。而且一般峰也相对更低（荧光信号相对弱）。 如果有产物，那扩增曲线很早就会出现；如果是30个循环之后才出现扩增曲线，那可能就是引物二聚体了。 空白对照，应该每次PCR里面都加入，可以检查是否有污染及引物二聚体的情况。 楼主在3楼里担心的片段大小与引物二聚体差不多这种情况，应该很难出现吧。两条引物加起来也就50bp不到，而荧光定量PCR的产物一般在150bp到300bp。所以，也可以在PCR之后跑个琼脂糖凝胶电泳，一般能区分开PCR产物和引物二聚体。 |
4楼2011-06-18 22:13:58
5楼2011-06-19 11:27:39
西瓜
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9楼2011-06-24 17:57:58
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10楼2011-06-25 00:48:08
