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wazlf

银虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】PCR后没有目的条带,有非特异性条带,求解决办法??

我做的是线粒体16s ,长度大约为600bp,但是PCR后没有目的条带,只有230bp左右的条带,附有图片,请哪位高手指导一下,非常感谢!
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★ ★ ★ ★ ★
rainwander(金币+5): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-02-27 16:32:41
wazlf(金币+5): 谢谢你了! 2011-02-28 13:09:42
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 15:44:31:
反应体系是50μL:mix25μL,水23μL,引物各0.5μL,模板1μL.那个是非特异性条带。怎样做改进,才能的到想要的条带?还有这事哪些方面的问题?

呵呵,非特异的好一致呀,我还以为是引物二聚体呢。

你做真核线粒体的16S,这个我没有做过,不知道在不同物种之间的保守性有没

有细菌那么高。你引物来源的那篇文献和你做的是一个物种的么?

如果那个是非特异性扩增,那么亮的话,说明你的引物还是没有设计好,我看你

的退火温度才51度,可以再延长引物以提高退火温度。这个我觉得是最快速的方

法了。

另外不知道你设计的引物的理论Tm是多少,可不可以在51度的基础上再拉高几

度呢?比如到55、58的样子。


还有就是可以做一个touchdown PCR看看结果会不会有改善。

上面这两个可以先做,没提高的话就别优化什么了,重新设计引物。
7楼2011-02-27 15:55:16
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★ ★
wazlf(金币+1): 2011-02-27 15:28:55
dhd997(金币+2): 对了 2011-02-28 10:46:11
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 13:47:57:
我做的是线粒体16s ,长度大约为600bp,但是PCR后没有目的条带,只有230bp左右的条带,附有图片,请哪位高手指导一下,非常感谢!

兄弟,以后有PCR的问题请在下面这个帖子里面问哈。

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2897252&fpage=1
2楼2011-02-27 13:49:42
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★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励发帖交流。 2011-02-27 14:07:04
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 13:47:57:
我做的是线粒体16s ,长度大约为600bp,但是PCR后没有目的条带,只有230bp左右的条带,附有图片,请哪位高手指导一下,非常感谢!

你指的230bp左右的条带是最左边的那个么?

觉得特异性好差啊,用的是通用引物还是你自己设计的呢?

PCR反应体系,条件也列一下吧。

中间那么多亮带是不是引物二聚体呢?
3楼2011-02-27 13:56:17
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,不好意思,楼主貌似是位MM,这个头像。。。。。。火影看多了。。
4楼2011-02-27 14:04:15
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