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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR后没有目的条带，有非特异性条带，求解决办法？？
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wazlf

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR后没有目的条带，有非特异性条带，求解决办法？？

我做的是线粒体16s ，长度大约为600bp，但是PCR后没有目的条带，只有230bp左右的条带，附有图片，请哪位高手指导一下，非常感谢！
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1楼2011-02-27 13:47:57
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★ ★ ★ ★
rainwander(金币+5): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-02-27 16:32:41
wazlf(金币+5): 谢谢你了！ 2011-02-28 13:09:42
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 15:44:31:
反应体系是50μL：mix25μL，水23μL，引物各0.5μL，模板1μL.那个是非特异性条带。怎样做改进，才能的到想要的条带？还有这事哪些方面的问题？

呵呵，非特异的好一致呀，我还以为是引物二聚体呢。

你做真核线粒体的16S，这个我没有做过，不知道在不同物种之间的保守性有没

有细菌那么高。你引物来源的那篇文献和你做的是一个物种的么？

如果那个是非特异性扩增，那么亮的话，说明你的引物还是没有设计好，我看你

的退火温度才51度，可以再延长引物以提高退火温度。这个我觉得是最快速的方

法了。

另外不知道你设计的引物的理论Tm是多少，可不可以在51度的基础上再拉高几

度呢？比如到55、58的样子。


还有就是可以做一个touchdown PCR看看结果会不会有改善。

上面这两个可以先做，没提高的话就别优化什么了，重新设计引物。
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7楼2011-02-27 15:55:16
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
wazlf(金币+1): 2011-02-27 15:28:55
dhd997(金币+2): 对了 2011-02-28 10:46:11
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 13:47:57:
我做的是线粒体16s ，长度大约为600bp，但是PCR后没有目的条带，只有230bp左右的条带，附有图片，请哪位高手指导一下，非常感谢！

兄弟，以后有PCR的问题请在下面这个帖子里面问哈。

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2897252&fpage=1
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2楼2011-02-27 13:49:42
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励发帖交流。 2011-02-27 14:07:04
引用回帖:
Originally posted by wazlf at 2011-02-27 13:47:57:
我做的是线粒体16s ，长度大约为600bp，但是PCR后没有目的条带，只有230bp左右的条带，附有图片，请哪位高手指导一下，非常感谢！

你指的230bp左右的条带是最左边的那个么？

觉得特异性好差啊，用的是通用引物还是你自己设计的呢？

PCR反应体系，条件也列一下吧。

中间那么多亮带是不是引物二聚体呢？
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3楼2011-02-27 13:56:17
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
，不好意思，楼主貌似是位MM，这个头像。。。。。。火影看多了。。
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4楼2011-02-27 14:04:15
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