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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 【求助/交流】请教Western blot出现非特异性条带的怎么解决
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crab1983

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请教Western blot出现非特异性条带的怎么解决

大家好，我的蛋白是30KD，我做Western blot封闭用的是30%的BSA，时间是4度过夜，我用的一抗是兔抗组氨酸标签抗体，37度孵育2h，二抗是羊抗兔的37度孵育2h，但是结果总出现非特异性条带，请高手帮帮忙！
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1楼2010-09-13 09:50:38
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
WB出现非特异性条带的原因与解决方法：
1.抗体浓度过高；降低一抗、二抗的浓度。
2.一抗的特异性不足；使用单克隆抗体。
3.二抗的非特异性结合，不加一抗，其他操作不变，即可检测出二抗的非特异性的条带是否来自二抗的非特异性结合；此时需要重新选择二抗。
4.样品蛋白质上样量过大；降低上样量。
5.样品蛋白质发生了降解，降解产物成为了一抗或二抗的新的抗原，尤其是在一抗或二抗不是单克隆抗体时更为明显；避免对样品蛋白质反复冻融，食用新鲜的蛋白质样品，可以使用蛋白酶的广谱抑制剂（已经有商用产品），必要的话使用分子筛层析或HPLC纯化蛋白质样品后再上样（HPLC不能用于蛋白质制备，不过用做WB的量还是能够提供的）。
6.细胞传代过多，导致蛋白质变异。使用传代次数少的细胞的表达的蛋白质进行对比，并且作为分子筛层析或HPLC的纯化标准。
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9楼2014-07-12 00:23:01
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ben1147

木虫 (正式写手)
根据具体条带情况选择优化洗膜或封闭
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2楼2010-09-13 09:53:15
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linysm

银虫 (小有名气)
看看杂带位子，如果在目的蛋白下面有可能是蛋白降解带，做的时候跟个对照吧。
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3楼2010-09-13 11:59:34
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
同意3楼的观点，从蛋白本身入手解决吧
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
4楼2010-11-12 18:46:59
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