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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » western blot 求助，请高手指点一下
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Fire0304

银虫 (小有名气)

[求助] western blot 求助，请高手指点一下

初次做western blot，蛋白分子量是57kD，
    第一次试验：浓缩胶4% 80V，分离胶10%，100V， PVDF膜转膜300mA 60min，丽春红染色无条带，封闭2h，一抗1:300，内参抗体1:500,4°C过夜，二抗1:2000,室温1h
     结果：目的蛋白6条带均出现，但不清晰，内参条带未见，多次压片结果同上。
    第二次试验：浓缩胶4%，40V，分离胶10%，85V，PVDF膜转膜250mA 80min，用上次及新配的一抗、内参抗体、二抗，余条件不变。
    结果：目的蛋白条带均未见。内参条带出现，但不清晰。多次压片结果同上。用考马斯亮蓝染胶未见蛋白条带。
    第三次实验：浓缩胶4%，30V，分离胶10%，60V，其余均与第二次实验条件相同，结果什么都没有看到，过后考马斯亮蓝染胶、染膜均可见清晰蛋白条带，但条带聚集较紧凑。
    分析：第一次实验有结果，但内参未见，第二次实验无结果，但可见内参一，用的是新旧一抗，内参抗体及二抗，第三次实验无结果，抗体同前，考虑一抗出现问题。
考马斯亮蓝染胶、染膜均可见清晰蛋白条带，但条带聚集较紧凑，考虑胶浓度过大。
     请各位高手指点一下，让小弟可顺利完成实验。。。。谢谢
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1楼2011-08-12 22:06:32
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Fire0304

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by qingyuansw20 at 2011-08-13 09:25:34:
告诉我一抗抗体是哪个公司的？我的条件浓缩胶5%，40V，分离胶10%。70V。转膜100ma。2.5小时。封闭2h。一抗37°2小时（santa抗体）。二抗37°一小时。结果相当好。

我也是santa抗体，抗体放久了影响大吗，因为是师姐去年留下的，B-actin和二抗也是同时期的，昨天又做了一次，目的蛋白没显示出条带，但B-actin较好显示出。
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7楼2011-08-15 19:49:20
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
帮顶下！
周末人少，耐心等等吧！
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2楼2011-08-13 00:38:43
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-08-13 15:46:50
告诉我一抗抗体是哪个公司的？我的条件浓缩胶5%，40V，分离胶10%。70V。转膜100ma。2.5小时。封闭2h。一抗37°2小时（santa抗体）。二抗37°一小时。结果相当好。
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3楼2011-08-13 09:25:34
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

补充，1:500一抗体。二抗1；1000。（碧云天二抗）
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4楼2011-08-13 09:27:14
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