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Fire0304

银虫 (小有名气)

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[求助] western blot 求助，请高手指点一下

初次做western blot，蛋白分子量是57kD，
第一次试验：浓缩胶4% 80V，分离胶10%，100V， PVDF膜转膜300mA 60min，丽春红染色无条带，封闭2h，一抗1:300，内参抗体1:500,4°C过夜，二抗1:2000,室温1h
结果：目的蛋白6条带均出现，但不清晰，内参条带未见，多次压片结果同上。
第二次试验：浓缩胶4%，40V，分离胶10%，85V，PVDF膜转膜250mA 80min，用上次及新配的一抗、内参抗体、二抗，余条件不变。
结果：目的蛋白条带均未见。内参条带出现，但不清晰。多次压片结果同上。用考马斯亮蓝染胶未见蛋白条带。
第三次实验：浓缩胶4%，30V，分离胶10%，60V，其余均与第二次实验条件相同，结果什么都没有看到，过后考马斯亮蓝染胶、染膜均可见清晰蛋白条带，但条带聚集较紧凑。
分析：第一次实验有结果，但内参未见，第二次实验无结果，但可见内参一，用的是新旧一抗，内参抗体及二抗，第三次实验无结果，抗体同前，考虑一抗出现问题。
考马斯亮蓝染胶、染膜均可见清晰蛋白条带，但条带聚集较紧凑，考虑胶浓度过大。
请各位高手指点一下，让小弟可顺利完成实验。。。。谢谢

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1楼2011-08-12 22:06:32

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w2boluo

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4, MolEPI+1): Good 2011-08-14 09:09:32
Fire0304(金币+5): 有帮助，实验后来算是成功了 2011-11-09 00:01:48

引用回帖:

1楼: Originally posted by Fire0304 at 2011-08-12 22:06:32:
初次做western blot，蛋白分子量是57kD，
第一次试验：浓缩胶4% 80V，分离胶10%，100V， PVDF膜转膜300mA 60min，丽春红染色无条带，封闭2h，一抗1:300，内参抗体1:500,4°C过夜，二抗1:2000,室温1h
结 ...

前后几次试验的page胶配制情况是否稳定？为何要不停的降低电压？
丽春红有时候不够敏感，染不出来的时候也不能确定就一定没转到膜上
丽春红能染上肯定是电泳和转膜都很不错了。
像你这种情况其实可以分别做2块胶，转2块膜，分别用第一次和第二次转膜的条件来做目的片段和内参。