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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Western Blot实验的蛋白条带都连在一起
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zplipeng

金虫 (著名写手)

[交流] Western Blot实验的蛋白条带都连在一起

如题：
探测内参actin的时候，各个条带并不很浓，但都连在一起，看不出泳道来。
会是什么原因。
另：有时转膜会出现星星样的小点，布满整个凝胶。
    大分子量蛋白往往有转移不好的情况，虽然并不影响自己探测的蛋白。
以下附上WB的详细步骤：
1、        细胞总蛋白的提取
A、        用培养皿（10cm）或培养瓶（75cm2）将细胞（Hela或HepG2）培养至约80-90%的平铺率；
B、        倒去培养基，并用PBS冲洗2-3次；
C、        加入0.5-1ml胰酶，37℃消化3-10min；
D、        加入3mL无血清培养基终止消化反应，并用枪头反复吹打至细胞从培养壁上脱落；
E、        收集细胞悬液至15mL离心管中，1500rpm离心10min收集细胞体（约100uL体积大小）；
F、        用500uL PBS重悬细胞并转移至1.5mL离心管中，3000-5000rpm离心5min收集细胞；
G、        弃去上清并用枪头吸干液体，加入50-200uL裂解液（RIPA已加入蛋白酶抑制剂），吹打均匀后，冰上放置20min，液氮反复冻融2-3次；
H、        14000×g离心15min，将上清收集到新的离心管中；
I、        以BSA为基准测定蛋白吸光度及浓度（约5-35mg/mL）。
2、        SDS-PAGE
A、        配置12%的分离胶（20mL）和3%的浓缩胶（10mL）；
B、        用2×Loading buffer（15uL）与蛋白提取液（15uL）等体积混匀后，沸水浴中煮5-10min；
C、        每孔上样20uL样品，5uL预染蛋白Marker，没有样品的孔加入5uL 2×Loading buffer；
D、        调节电压100V（或先80V再120V）电泳90-120min；
E、        转膜的胶水中暂存，另一块可以直接染色（考马斯亮蓝染液中煮沸5-10min，脱色）。
3、        转膜
A、        用转膜缓冲液浸湿转膜器件（夹子、滤纸、垫片）并依次排好；
B、        将剪好的PVDF膜（0.45um）（比胶略大但比滤纸小）先在甲醇中浸湿（不超过15s），后覆盖在正极滤纸上；
C、        随后将胶覆盖在PVDF膜上；
D、        再放上一层滤纸后，用玻璃棒或15mL离心管赶出气泡；
E、        夹好夹子，放入转移槽，加满转移缓冲液；
F、        20V转移过夜，一块膜时电流大约为13-15mA，用的是六一的转移槽；
G、        转好的膜放入TBST缓冲液中。
4、        免疫印迹
A、        用TBST配置的5%脱脂奶封闭膜（4℃过夜或37℃ 1hr）；
B、        用TBST配置的5%脱脂奶作为稀释液，加入一抗（1:300（β-actin）），37℃孵育1hr（或4℃过夜）；
C、        TBST洗涤膜5min，2次，然后用TBST配置的5%脱脂奶作为稀释液，加入二抗（1:5000，牛抗兔二抗），37℃孵育1hr；
D、        TBST洗涤膜5min，2次，用于显色反应。
5、        发光反应
A、        加入一定量ECL（整块膜大约需要2.5-3mL的ECL混合液），将膜全部覆盖；
B、        5min后，移入暗室准备压片（光片剪角），视荧光强度选择压片时间；
C、        压片10s-2min，后分别显影（可在灯下观察显影强度，控制显影时间），定影（2min即可）；
D、        膜保存在TBST中，可反复利用。

总蛋白SDS-PAGE后用考马斯亮蓝染色：可见泳道间扩散相连



actin的WB结果 连成一条线而看不出泳道



转膜后的凝胶用考马斯亮蓝染色 有时会出现星星样的点点



但大部分还是这种情况：90kD一下蛋白转移较好，而大分子量蛋白往往转移不好（20V overnight）



[ Last edited by zplipeng on 2011-12-8 at 14:34 ]
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1楼 2011-12-04 21:15:25
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
★
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zplipeng(金币+1): 多谢！我回头过滤一下试试，您那边浓缩胶和分离胶缓冲液的pH值是不是分别为8.8和6.8？ 2011-12-08 20:52:39
首先，配胶的所有溶液都要0.45微米滤膜过滤的，不能有杂质沉淀，都要用去离子水去配制。过硫酸铵和TEMED可能不用过滤。tris的PH值也很关键，影响条带的宽窄。
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11楼2011-12-08 15:10:32
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vine010

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zplipeng(金币+1): 蛋白量感觉也不多，因为最后的WB条带并不粗。我用的12%的分离胶。 2011-12-08 14:36:40
量加多了，胶的浓度是不是有问题。
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5楼2011-12-05 16:30:26
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cuier124

金虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-12-06 12:18:37
zplipeng(金币+1): 用的RIPA提取缓冲液，网上找的配方。您的意思是Loading buffer中溴酚蓝质量有问题还是量加的可能不对？ 2011-12-08 14:38:38
zplipeng(金币+2): 我们的抗体是博奥森公司的（国产），1:1000的做过，出不来条带。ECL的量也有影响吗？个人觉得只要铺满整个膜是不是就可以了！转膜在300mA中转1.5h我也用过，效果也是如此。另外询问一个问题，您做过信号转导方面的东西，是不是磷酸化蛋白检测时需要的浓度时比较大的？我用非磷酸化抗体探测时可以探测到条带（也不粗），但是磷酸化蛋白的抗体总是探测不到条带，不知是真的没有表达，还是探测的问题。 2011-12-08 20:49:10
zplipeng(金币+5): 我们老板购买的Roche的蛋白酶抑制剂，他说他们做蛋白磷酸化就用这个，不用再加磷酸酶抑制剂。我表示怀疑。 2011-12-12 19:30:24
照你说的情况看，是你的蛋白样品在胶里扩散性太强了，所以可能是你样品制作的有问题吧，检查一下loading buffer的配制可有问题，特别使样品下沉的溴酚蓝；还有就是电泳时的电压和时间也会影响电泳结果；如果实验室的此实验条件不成熟，还要好好摸索啊，祝你好运！


我个人认为是Loading buffer中溴酚蓝的量的问题，质量有问题肯定也有影响；
从你的方法和图片看，个人认为：你actin抗体的浓度可能大了(我们实验室内参一抗浓度1:1000，当然具体要看抗体来源和说明)，ECL的量和压片时间没把握好，导致你actin的WB显影结果连成一条线而看不出泳道；
转膜大分子转不过来应该是你转膜条件不佳（我们实验室是300mA冰中转1.5h）
你再查些资料看看问题到底在哪儿吧，祝好运！


我觉得磷酸化的蛋白是不太好检测，蛋白少信号弱可适当加大上样量，做磷酸化的蛋白RIPA一定要加磷酸酶抑制剂，我们的RIPA是购买的含磷酸酶抑制剂的，您自己配制也应该加进去

[ Last edited by cuier124 on 2011-12-12 at 09:13 ]
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6楼2011-12-05 21:58:28
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cixinkejian

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zplipeng(金币+1): 界面不好？？？这个可有办法解决？ 2011-12-08 14:54:14
或许是因为配胶的时候，分离胶和浓缩胶的界面结合的不好造成的呢。
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7楼2011-12-06 00:05:37
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