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jqjs

新虫 (初入文坛)

[交流] Western Blot 磷酸化蛋白测定问题 已有8人参与

WB菜鸟最近做ERK蛋白表达

用的碧云天的Western及IP细胞裂解液(说明说适用于磷酸化蛋白的Western检测)
伯乐半干转膜 恒压20V,25min
5%脱脂奶室温摇床封闭1h
一抗室温摇床1h,4度过夜
HRP标记的二抗室温摇床孵育1小时
TMB显色

结果:ERK蛋白表达有条带
          p-ERK在NC膜上只有预染Marker没有任何条带或是背景

请教WB达人为什么p-ERK会是这样的情况,还有这个问题要怎么解决?
各位大侠赐教呀!!!

[ Last edited by amisking on 2009-10-15 at 22:05 ]
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314300420

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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by jqjs at 2009-10-15 20:50:46:
WB菜鸟最近做ERK蛋白表达

用的碧云天的Western及IP细胞裂解液(说明说适用于磷酸化蛋白的Western检测)
伯乐半干转膜 恒压20V,25min
5%脱脂奶室温摇床封闭1h
一抗室温摇床1h,4度过夜
HRP标记的二抗室温摇 ...

磷酸化蛋白封闭和稀释一抗建议用3%BSA,不选择奶粉,如果你的Erk或者内参能出的很好,只有p-Erk不出,可以考虑是一抗的问题,可以加大抗体浓度,或者换抗体
3楼2011-04-11 14:56:39
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南湖山下

新虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我的ERK也很悲剧,总是背景很脏,怎么洗也洗不掉,有高手能指点一下吗
2楼2011-04-11 13:03:38
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Originally posted by 南湖山下 at 2011-04-11 13:03:38:
我的ERK也很悲剧,总是背景很脏,怎么洗也洗不掉,有高手能指点一下吗

目的蛋白条带是否够亮,如果目的条带很亮可以降低抗体浓度试试,如果目的蛋白条带也不够清晰,说明抗体效价不行,可以换抗体试试。Erk可以说是比较好做的蛋白,我做了很多样品的Erk和p-Erk,表达量都很高。

4楼2011-04-11 15:06:02
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liushang1990

木虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
呃,制样有没有加磷酸酶抑制剂?最好用新鲜的蛋白样品,并且裂解液里加了磷酸酶抑制剂。
基督耶稣降世,为要拯救罪人。
6楼2013-08-13 17:18:32
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