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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Western Blot 磷酸化蛋白测定问题
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jqjs

新虫 (初入文坛)

[交流] Western Blot 磷酸化蛋白测定问题已有8人参与

WB菜鸟最近做ERK蛋白表达

用的碧云天的Western及IP细胞裂解液（说明说适用于磷酸化蛋白的Western检测）
伯乐半干转膜 恒压20V，25min
5%脱脂奶室温摇床封闭1h
一抗室温摇床1h，4度过夜
HRP标记的二抗室温摇床孵育1小时
TMB显色

结果：ERK蛋白表达有条带
          p-ERK在NC膜上只有预染Marker没有任何条带或是背景

请教WB达人为什么p-ERK会是这样的情况，还有这个问题要怎么解决？
各位大侠赐教呀！！！

[ Last edited by amisking on 2009-10-15 at 22:05 ]
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1楼2009-10-15 20:50:46
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小强001

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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4楼: Originally posted by 314300420 at 2011-04-11 15:06:02
目的蛋白条带是否够亮，如果目的条带很亮可以降低抗体浓度试试，如果目的蛋白条带也不够清晰，说明抗体效价不行，可以换抗体试试。Erk可以说是比较好做的蛋白，我做了很多样品的Erk和p-Erk，表达量都很高。

...

大神啊，这么亮的条带，请教一下，磷酸化抗体用的哪个公司的啊
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无
8楼2014-07-28 17:07:51
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南湖山下

新虫 (初入文坛)
★
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我的ERK也很悲剧，总是背景很脏，怎么洗也洗不掉，有高手能指点一下吗
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2楼2011-04-11 13:03:38
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314300420

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Originally posted by jqjs at 2009-10-15 20:50:46:
WB菜鸟最近做ERK蛋白表达

用的碧云天的Western及IP细胞裂解液（说明说适用于磷酸化蛋白的Western检测）
伯乐半干转膜 恒压20V，25min
5%脱脂奶室温摇床封闭1h
一抗室温摇床1h，4度过夜
HRP标记的二抗室温摇 ...

磷酸化蛋白封闭和稀释一抗建议用3%BSA，不选择奶粉，如果你的Erk或者内参能出的很好，只有p-Erk不出，可以考虑是一抗的问题，可以加大抗体浓度，或者换抗体
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3楼2011-04-11 14:56:39
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314300420

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Originally posted by 南湖山下 at 2011-04-11 13:03:38:
我的ERK也很悲剧，总是背景很脏，怎么洗也洗不掉，有高手能指点一下吗

目的蛋白条带是否够亮，如果目的条带很亮可以降低抗体浓度试试，如果目的蛋白条带也不够清晰，说明抗体效价不行，可以换抗体试试。Erk可以说是比较好做的蛋白，我做了很多样品的Erk和p-Erk，表达量都很高。
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4楼2011-04-11 15:06:02
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