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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » western blot 半干式电转转不上问题！！快来帮帮忙啊！！
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wxz1017

金虫 (小有名气)

[求助] western blot 半干式电转转不上问题！！快来帮帮忙啊！！

最近做western blot 目的蛋白大概30kD左右，用半干式电转，仪器都是伯乐的，电压15v，转1h，转了好几次都没转上，转的时候刚开始电流30mA，过几分钟就成20多了，功率刚开始是1，后来是0，感觉电流太小了，高手快来帮帮个忙啊！！
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1楼 2012-11-20 16:53:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
半干转移可以用稳压，也可以用稳流。我通常是做稳流。所需电流（mA）=胶的面积（平方厘米）。一般开始的时候电压为6-7v，一个小时后电压是12-15V。半干转移的功率比湿法要小很多，虽然不知道你的胶是多大的，但我觉得你说的数据不是很离谱。为什么转不上去可能有其它原因。你的marker是不是转上去了呢？
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wxz1017
2楼2012-11-21 07:28:32
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
Marker有没有转上去？是不是机器出问题了？或者短路啥的
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4楼2012-11-21 09:07:36
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子曰包子好吃

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主可以试下湿转，我们这边20多KD的 100V 50分钟就很好了
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3楼2012-11-21 08:12:29
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wxz1017

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-21 07:28:32
半干转移可以用稳压，也可以用稳流。我通常是做稳流。所需电流（mA）=胶的面积（平方厘米）。一般开始的时候电压为6-7v，一个小时后电压是12-15V。半干转移的功率比湿法要小很多，虽然不知道你的胶是多大的，但我觉 ...

就是因为maker都没转上所以才这么着急！我用的胶板是下层12%5ml，加样时前五个后五个重复一模一样，用的预染maker，转的时候胶面积是下层胶的一半，按说电流也正常啊！怎么就转不上呢？
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5楼2012-11-21 12:29:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by wxz1017 at 2012-11-21 12:29:22
就是因为maker都没转上所以才这么着急！我用的胶板是下层12%5ml，加样时前五个后五个重复一模一样，用的预染maker，转的时候胶面积是下层胶的一半，按说电流也正常啊！怎么就转不上呢？...

预染的marker都没有的确是有问题，转移缓冲液没有问题吗？会不会是三明治放反了？
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6楼2012-11-21 15:13:18
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wxz1017

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-21 15:13:18
预染的marker都没有的确是有问题，转移缓冲液没有问题吗？会不会是三明治放反了？...

缓冲液是新配的，三明治结构胶在上膜在下这些应该没问题.
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7楼2012-11-21 15:22:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by wxz1017 at 2012-11-21 15:22:31
缓冲液是新配的，三明治结构胶在上膜在下这些应该没问题....

你做的三明治是不是滤纸、胶、膜都是一样大？与湿法不同的是，如果滤纸太大有时候转移效果差。
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8楼2012-11-21 15:31:52
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wxz1017

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-21 15:31:52
你做的三明治是不是滤纸、胶、膜都是一样大？与湿法不同的是，如果滤纸太大有时候转移效果差。...

是都一样大，滤纸还要稍微大点，我再把滤纸减小点试试吧！
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9楼2012-11-22 11:15:05
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sunshinewzy

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我有个同学遇到过跟你相同的问题，他最后解决的办法是把三明治结构弄紧了一些，可以多加一点滤纸，可能是三明治结构太松散蛋白转到buffer里面去了。我用湿法转膜，有一次专用的转膜滤纸没有了，自己剪的滤纸，夹的很紧也没有问题的~
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10楼2012-11-22 12:21:10
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