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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教Western blot问题
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yuyang031985

金虫 (正式写手)

[求助] 请教Western blot问题 已有1人参与

最近在做Western blot，提取耐药细胞的p-gp蛋白，文献报道理论分子量170kd，我们跑出来的分子量130kd左右，而且还不确定是不是该条带，请高人指点哪里有可能出问题？？

已使用过的抗体：Abcam的p-gp抗体（兔抗、鼠抗都用过）；博士德的p-gp抗体
胶的浓度：6%、8%、10%和12%都使用过；
裂解液：碧云天的强、中强、弱的裂解液都试过；
提蛋白的方法：总蛋白和膜蛋白的提取都尝试过；
使用的膜：0.22微米的PVDF膜
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1楼 2013-08-07 16:33:57
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hongyongbo

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
该蛋白是否有亚基，在提取纯化过程中降解导致少了40KD
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2楼2013-08-07 21:08:26
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hongyongbo

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

还要考虑下可变剪切
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3楼2013-08-07 21:09:04
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biowandy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
请问具体蛋白是什么名字？可以上uniprot研究下蛋白特性，
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4楼2013-08-07 21:59:09
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jiang701820

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
改蛋白是否还有其他修饰，我之前也有过这样的经历，文献报道在120kDa，但是我做出来始终在56kDa，而且我买的抗体说明书上也是写的56kDa，这些抗体做出来再120kDa也没有条带，后来查了文献发现这个蛋白存在糖基化，糖基化后分子量会达到120kDa，所以你可以查一下你现在这个蛋白的氨基酸序列，算一下大概有多少Kda，如果说氨基酸序列算出来有170kDa的话，那可能你的实验确实存在一定问题，考虑换其他公司的抗体，另外建议用0.45uM的PVDF膜，因为该蛋白的分子量比较大。如果氨基酸序列算出来的分子量在130kDa左右的话可能是该蛋白存在其他修饰。
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5楼2013-08-07 22:09:32
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yuyang031985

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jiang701820 at 2013-08-07 22:09:32
改蛋白是否还有其他修饰，我之前也有过这样的经历，文献报道在120kDa，但是我做出来始终在56kDa，而且我买的抗体说明书上也是写的56kDa，这些抗体做出来再120kDa也没有条带，后来查了文献发现这个蛋白存在糖基化，糖 ...

非常感谢，我们试试看行不行
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6楼2013-08-08 17:05:17
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yuyang031985

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by biowandy at 2013-08-07 21:59:09
请问具体蛋白是什么名字？可以上uniprot研究下蛋白特性，

蛋白就是叫P-gp膜蛋白
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7楼2013-08-08 17:05:42
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yuyang031985

金虫 (正式写手)
比较奇怪的是，我们参考文献里的方法，操作步骤什么的基本上都差不多，不同的地方有：
1）有用NC膜的，我们用的是0.22的PVDF膜；
2）抗体不一样，但也有文献用我们选的抗体做出来的；
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8楼2013-08-08 17:07:57
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酷哥哥1990

金虫 (小有名气)
我也是做耐药细胞中P-糖蛋白表达的，也遇到了和你一样的问题。。。。请问你这个问题解决了吗？还有就是膜蛋白你是怎么提取的？
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9楼2014-02-24 14:40:06
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jiaolong11a

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

有的蛋白可能有亚型，你具体看看啥情况
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多情总被无情扰。。。愁
10楼2014-02-24 14:56:29
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