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yuyang031985金虫 (正式写手)
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[求助]
请教Western blot问题 已有1人参与
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最近在做Western blot，提取耐药细胞的p-gp蛋白，文献报道理论分子量170kd，我们跑出来的分子量130kd左右，而且还不确定是不是该条带，请高人指点哪里有可能出问题？？ 已使用过的抗体：Abcam的p-gp抗体（兔抗、鼠抗都用过）；博士德的p-gp抗体 胶的浓度：6%、8%、10%和12%都使用过； 裂解液：碧云天的强、中强、弱的裂解液都试过； 提蛋白的方法：总蛋白和膜蛋白的提取都尝试过； 使用的膜：0.22微米的PVDF膜 |
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hongyongbo
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3楼2013-08-07 21:09:04
hongyongbo
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2楼2013-08-07 21:08:26
biowandy
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4楼2013-08-07 21:59:09
jiang701820
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
| 改蛋白是否还有其他修饰，我之前也有过这样的经历，文献报道在120kDa，但是我做出来始终在56kDa，而且我买的抗体说明书上也是写的56kDa，这些抗体做出来再120kDa也没有条带，后来查了文献发现这个蛋白存在糖基化，糖基化后分子量会达到120kDa，所以你可以查一下你现在这个蛋白的氨基酸序列，算一下大概有多少Kda，如果说氨基酸序列算出来有170kDa的话，那可能你的实验确实存在一定问题，考虑换其他公司的抗体，另外建议用0.45uM的PVDF膜，因为该蛋白的分子量比较大。如果氨基酸序列算出来的分子量在130kDa左右的话可能是该蛋白存在其他修饰。 |
5楼2013-08-07 22:09:32
