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lxyzsx

新虫 (初入文坛)

[求助] western-blot的问题!!! 已有4人参与

各位大神,你们好:

    小弟最近做目的蛋白WB检测,从植物种子中粗提蛋白,两块胶,一快染色,一快WB。
    问题是:阳性对照有条带,很清晰(阳性对照为纯化的蛋白),而检测的蛋白却没有条带,而用ELISA检测同样的检测样品,结果呈阳性。为什么ELISA能检测出来,而WB检测不出来呢?
    上样量做过梯度,转膜电流、时间也摸索过
    但是为什么会出现这种情况呢?还请各位大神显灵吧,小弟拜谢了!
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puhebio

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
ELISA和WB的灵敏度完全不是一个级别,Elisa的检测限可以达到ng级别,可能是你的目的蛋白量比较少,上样量的摸索时,你所看到的条带多数是你的杂蛋白,另外转膜后面加抗体孵育、显色的时候也查查有没有问题。
3楼2014-02-25 22:24:25
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hellokkzhu

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
一般情况,elisa的灵敏度比wb要高100-1000倍,所以elisa有阳性结果wb不一定检测到条带。如果蛋白较小比如10kd以下,wb的检测更不灵敏。
建议:用纯化蛋白作为标准品做elisa定量,看你的目的蛋白丰度,如果丰度低可以加大上样量,提高抗体工作液浓度。
2楼2014-02-25 20:04:20
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lxyzsx

新虫 (初入文坛)

ok,再试试上样量,和一抗fuyu时间,谢谢!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2014-02-26 06:41:01
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turnaward

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

他们的作用好像不是一样的吧!wb是和变性的蛋白结合的而elise却不是的。所以可能和你的抗体有关的吧。如果不是这个原因找到了给我回一下的哈、
5楼2014-02-28 22:10:39
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