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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » western-blot实验结果，大家帮忙分析下
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迷情八月

金虫 (正式写手)

[交流] western-blot实验结果，大家帮忙分析下 已有4人参与

我最近在做一个关于纯化抗体的课题，抗原E-coli表达后，自己纯化的 ，跑胶的时候，发现比较纯，只有一条目的蛋白的主带。然后免疫小鼠 筛选杂交瘤细胞，抗体纯化后，用western检测抗体的纯度，实验结果如下图，上样孔分别是：Maker（自己做的，没预染，所以看不到）；阴性对照，Ecoli（1:10稀释）空菌；阴性对照，Ecoli（1:100稀释）裂解液；目的蛋白（1:10）稀释；目的蛋白（1:100）稀释；目的蛋白（1:500）稀释。目的大小23KD。
        实验结果，阴性对照孔两个基本上没有颜色，可以断定我们的抗体和细菌蛋白是没有交叉反应的；目的蛋白均能染出颜色，但令人纠结的是，为什么1:10稀释的目的蛋白（颜色最亮的那条）上方会多出一条带（对了一下maker，大约50左右）？
       这个实验结果是否能说明，我得到的抗体是纯的？求大神指点


[ Last edited by 迷情八月 on 2012-3-17 at 14:27 ]
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日子妞儿

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1楼 2012-03-17 14:24:07
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迷情八月

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lcppp1974 at 2012-03-17 15:46:02:
我估计会不会是你目标蛋白的二聚体？因为目标蛋白的MW=23 kDa,  23 x 2 = 46 kDa.在电泳水平上，46和50 kDa是很难区分的。更何况50 kDa你也是估计的。因此建议你加入ME或DTT（切断双硫键）后再试一次，如果是-SS- ...

我上的是还原的buffer，我们自己也认为可能是形成二聚体了，会不会是二聚体的浓度太高了，DTT还来不及还原？
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5楼2012-03-19 08:18:01
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lcppp1974

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我估计会不会是你目标蛋白的二聚体？因为目标蛋白的MW=23 kDa,  23 x 2 = 46 kDa.在电泳水平上，46和50 kDa是很难区分的。更何况50 kDa你也是估计的。因此建议你加入ME或DTT（切断双硫键）后再试一次，如果是-SS-键，那你加入还原剂后就会变成一条带。希望该休息对你有用。
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3楼2012-03-17 15:46:02
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水水726

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
如果是杂带的话，是不是你一抗浓度太大了，稀释下试试
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4楼2012-03-17 21:10:47
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lcppp1974

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
蛋白样品中你最好用DTT，它能较稳定地把SS还原为SH，且要加大浓度，因为我推测你的目标蛋白中的SH很容易形成SS，因此要加过量的DTT。

还有，也许你的还原时间不够。还原条件：沸水，5min。常温，>5h.

仅供参考。
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6楼2012-03-19 13:30:32
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