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迷情八月

金虫 (正式写手)

[交流] western-blot实验结果,大家帮忙分析下 已有4人参与

我最近在做一个关于纯化抗体的课题,抗原E-coli表达后,自己纯化的 ,跑胶的时候,发现比较纯,只有一条目的蛋白的主带。然后免疫小鼠 筛选杂交瘤细胞,抗体纯化后,用western检测抗体的纯度,实验结果如下图,上样孔分别是:Maker(自己做的,没预染,所以看不到);阴性对照,Ecoli(1:10稀释)空菌;阴性对照,Ecoli(1:100稀释)裂解液;目的蛋白(1:10)稀释;目的蛋白(1:100)稀释;目的蛋白(1:500)稀释。目的大小23KD。
        实验结果,阴性对照孔两个基本上没有颜色,可以断定我们的抗体和细菌蛋白是没有交叉反应的;目的蛋白均能染出颜色,但令人纠结的是,为什么1:10稀释的目的蛋白(颜色最亮的那条)上方会多出一条带(对了一下maker,大约50左右)?
       这个实验结果是否能说明,我得到的抗体是纯的?求大神指点


[ Last edited by 迷情八月 on 2012-3-17 at 14:27 ]
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水水726

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
如果是杂带的话,是不是你一抗浓度太大了,稀释下试试
4楼2012-03-17 21:10:47
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lcppp1974

金虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我估计会不会是你目标蛋白的二聚体?因为目标蛋白的MW=23 kDa,  23 x 2 = 46 kDa.在电泳水平上,46和50 kDa是很难区分的。更何况50 kDa你也是估计的。因此建议你加入ME或DTT(切断双硫键)后再试一次,如果是-SS-键,那你加入还原剂后就会变成一条带。希望该休息对你有用。
3楼2012-03-17 15:46:02
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迷情八月

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lcppp1974 at 2012-03-17 15:46:02:
我估计会不会是你目标蛋白的二聚体?因为目标蛋白的MW=23 kDa,  23 x 2 = 46 kDa.在电泳水平上,46和50 kDa是很难区分的。更何况50 kDa你也是估计的。因此建议你加入ME或DTT(切断双硫键)后再试一次,如果是-SS- ...

我上的是还原的buffer,我们自己也认为可能是形成二聚体了,会不会是二聚体的浓度太高了,DTT还来不及还原?
5楼2012-03-19 08:18:01
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lcppp1974

金虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
蛋白样品中你最好用DTT,它能较稳定地把SS还原为SH,且要加大浓度,因为我推测你的目标蛋白中的SH很容易形成SS,因此要加过量的DTT。

还有,也许你的还原时间不够。还原条件:沸水,5min。常温,>5h.

仅供参考。
6楼2012-03-19 13:30:32
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