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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】原核表达蛋白纯化
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泡泡9706

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】原核表达蛋白纯化 已有15人参与

在大肠杆菌BL21中表达了一个酶，产生包涵体，优化后可以产生有活性的该酶。镍柱纯化时在目的条带附近总伴随有另一条带（或者多条），用了离子交换除不去，而且也不知道哪条是我的目的条带。有图

请高人指教有何办法将其分纯？
  另外：包涵体蛋白和胞内上清中的目的蛋白跑SDS-PAGE时，条带一定在同一位置出现吗？

[ Last edited by 泡泡9706 on 2010-6-13 at 11:13 ]
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1楼 2010-06-12 17:02:35
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1178391楼: Originally posted by 月月大可 at 2012-05-10 17:05:07:
好多年前的帖子了，早就忘记我还回复过这个帖子。重新温习了一下，才确定是我说的,呵呵。
浓度具体多少忘记了，貌似我当时加的是2-5mM吧，因为我要使用Ni柱纯化，如果浓度过高，它就将Ni离子还原为+1价，失去抓 ...

多谢呀~救急的回复啊！我之前也是查过说巯基乙酸酸性下稳定，但是碱性下才起作用，但是具体的没查到。
我也是要过Ni柱，说明书上说的浓度不能超过20mM。

那我还想请教一下，全程加还原剂，最后总是要透析去除巯基乙醇的吧？还是说一直蛋白纯化之后的，也是以含巯基乙醇的缓冲液做溶剂？
赞一下 回复此楼
25楼2012-05-10 18:06:41
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1):欢迎交流！ 2010-06-12 21:18:40
泡泡9706(金币+1):这样啊，谢谢！ 2010-06-13 08:32:50
包涵体蛋白和胞内上清中的目的蛋白跑SDS-PAGE时，目的条带一般是相同位置的，不过你这个纯化不容易，帮顶一下
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2010-06-12 17:18:47
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-15 07:48:04
泡泡9706(金币+1):多谢指教 2010-06-17 17:03:47
泡泡9706(金币+1): 2010-06-17 17:05:51
可能都是，信号肽的有无，原核么，很可能有的把信号肽切了，有的没有切，或者二者都存在，你查下外文文献，有说的，希望对你有帮助~
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3楼2010-06-13 16:59:37
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黑罕

金虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-15 07:48:11
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-15 07:48:57
泡泡9706(金币+1):做了western，用的his标签的抗体，都能染出来……据说国产的抗体特异性不好…… 2010-06-17 17:04:28
做wester blot 鉴定出你的条带，如果还不行就只能做质谱了
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4楼2010-06-13 18:35:03
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