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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】原核表达蛋白纯化
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
泡泡9706(金币+1): 2010-06-17 17:08:58
lstt09nk(金币+2):感谢交流~~ 2010-06-18 11:04:10
建议你用低温过夜诱导，可能就不会去现你的这种情况了，而且目标蛋白的丰度也会高很多了。你的这种现象在37度诱导时出现在概率不是很大，但也不是很难遇见，原因不是很简单，楼上几位说的都有可能，我的意见是蛋白表达的速度太快了！！
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11楼2010-06-15 13:24:44
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
转个空质粒进去，诱导一下做个对照试试
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12楼2010-06-15 13:26:59
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泡泡9706

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by mazhenning at 2010-06-13 20:13:15:
有没有重复一下，都是接近的两条带吗？
我之前也有过同一种蛋白，但是跑出来会有两条紧挨的带，不过我那种情况是蛋白电泳的问题。所以，也许你这两条带都是你的目标蛋白。或者是电泳条件，或者是被分解等原因，导 ...

我也想问一下，蛋白电泳的什么问题会导致这样呢？
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13楼2010-06-17 17:07:07
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泡泡9706

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-06-15 08:46:50:
怀疑是构象不同引起的。
想问楼主离子交换柱洗脱峰的对称性如何？  
另外检查目的蛋白中半胱氨酸的个数。如果有两个以上，蛋白纯化过程中是否全程加的有还原剂？
电泳的时候使用的 Loading buffer 中是否加入还 ...

这个蛋白只有一个半胱氨酸
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14楼2010-06-17 17:08:34
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泡泡9706

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ganchao1776 at 2010-06-15 13:24:44:
建议你用低温过夜诱导，可能就不会去现你的这种情况了，而且目标蛋白的丰度也会高很多了。你的这种现象在37度诱导时出现在概率不是很大，但也不是很难遇见，原因不是很简单，楼上几位说的都有可能，我的意见是蛋白 ...

我是低温诱导的
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15楼2010-06-17 17:09:09
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123qsz321

木虫 (正式写手)

爬坡的土鳖
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
做杂交吧
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16楼2010-06-17 18:05:20
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk:还有这样的啊，有意思~~ 2010-06-18 11:06:00
引用回帖:
Originally posted by 泡泡9706 at 2010-06-17 17:08:34:

这个蛋白只有一个半胱氨酸

偶感觉还是构象的问题可能比较大，我原来把不同批次的蛋白混合在一起，然后跑SDS-PAGE出来了三条带，都是我的目的蛋白。

不同菌落、不同批次纯化出来的蛋白构象可能不一样。
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17楼2010-06-17 19:10:11
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biogefart

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by gene001 at 2010-06-15 00:43:24:
你表达的酶基因是不是含有信号肽序列？如果有，可能该信号肽在大肠杆菌胞内可溶表达部分被切去了信号肽，而包涵体表达部分没有被切去信号肽，这样导致了出现这两条吧！如果有该酶的抗体，你做一下western blot检测 ...

这是不可能的！！！不溶的包涵体怎么会挂在可溶蛋白的Ni柱上，楼主肯定不是用的包涵体的纯化方法吧！！
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闹太套
18楼2010-06-17 20:28:45
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-06-18 11:06:25
还有一种可能就是你所表达的蛋白所处的状态不是一致的，部分为氧化态，部分是还原态的。在电泳分离的过程中会有一点的差异。
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19楼2010-06-18 10:30:44
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泡泡9706

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-06-17 19:10:11:


偶感觉还是构象的问题可能比较大，我原来把不同批次的蛋白混合在一起，然后跑SDS-PAGE出来了三条带，都是我的目的蛋白。

不同菌落、不同批次纯化出来的蛋白构象可能不一样。

我也发现我不同批次的蛋白纯化出来后，虽然都会有两条主带，可是两条蛋白带的相对多少却不一样，有时候是上面那条比较浓，有时候是下面那条比较浓
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20楼2010-06-18 10:58:41
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