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泡泡9706

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】原核表达蛋白纯化 已有15人参与

在大肠杆菌BL21中表达了一个酶,产生包涵体,优化后可以产生有活性的该酶。镍柱纯化时在目的条带附近总伴随有另一条带(或者多条),用了离子交换除不去,而且也不知道哪条是我的目的条带。有图

请高人指教有何办法将其分纯?
  另外:包涵体蛋白和胞内上清中的目的蛋白跑SDS-PAGE时,条带一定在同一位置出现吗?

[ Last edited by 泡泡9706 on 2010-6-13 at 11:13 ]
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biogefart

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by gene001 at 2010-06-15 00:43:24:
你表达的酶基因是不是含有信号肽序列?如果有,可能该信号肽在大肠杆菌胞内可溶表达部分被切去了信号肽,而包涵体表达部分没有被切去信号肽,这样导致了出现这两条吧!如果有该酶的抗体,你做一下western blot检测 ...

这是不可能的!!!不溶的包涵体怎么会挂在可溶蛋白的Ni柱上,楼主肯定不是用的包涵体的纯化方法吧!!
闹太套
18楼2010-06-17 20:28:45
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jasco

木虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+1):欢迎交流! 2010-06-12 21:18:40
泡泡9706(金币+1):这样啊,谢谢! 2010-06-13 08:32:50
包涵体蛋白和胞内上清中的目的蛋白跑SDS-PAGE时,目的条带一般是相同位置的,不过你这个纯化不容易,帮顶一下
2楼2010-06-12 17:18:47
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liyong1981

金虫 (正式写手)



reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-15 07:48:04
泡泡9706(金币+1):多谢指教 2010-06-17 17:03:47
泡泡9706(金币+1): 2010-06-17 17:05:51
可能都是,信号肽的有无,原核么,很可能有的把信号肽切了,有的没有切,或者二者都存在,你查下外文文献,有说的,希望对你有帮助~
3楼2010-06-13 16:59:37
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黑罕

金虫 (小有名气)

★ ★
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-15 07:48:11
reasonspare(金币+1):谢谢分享。 2010-06-15 07:48:57
泡泡9706(金币+1):做了western,用的his标签的抗体,都能染出来……据说国产的抗体特异性不好…… 2010-06-17 17:04:28
做wester blot 鉴定出你的条带,如果还不行就只能做质谱了
4楼2010-06-13 18:35:03
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