蛋白表达及纯化 - 分子生物 - 综合其他 - 第3页小木虫论坛-学术科研互动平台

liushuizhf

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21楼: Originally posted by zhangyi05 at 2013-07-23 17:04:19
W是野生型？
这么看起来的话应该是表达了。...

W是野生型，真的是表达了吗，那我为什么纯化不到呢，对于纯化发酵液汇中的蛋白您有什么好的建议吗？

22楼2013-07-23 18:11:09

liushuizhf

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20楼: Originally posted by lifuzhu3838 at 2013-07-23 15:57:30

我也是菜鸟，不要介意...

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23楼2013-07-23 18:13:47

yxncas-2012

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17楼: Originally posted by liushuizhf at 2013-07-22 00:43:24
您好，您提的这个问题特别好，因为之前没有做过此类实验，所以也不太确定应该是什么样的，重新跑的蛋白电泳疑是目的条带挺亮的，但是野生型也有一条比较浅的条带，所以想请您看一下这是不是您说的”比野生型明显多 ...

这样来看，那个应该是你表达的目的蛋白！
表达的就应该有这样的效果，同时你也要看看分子量是不是接近你的目的蛋白大小。
你测序的时候，测序是不是正确，你的his-tag标签是不是正确加到了你的目的蛋白上面！要是这些没有问题，理论上用Ni亲和就很容易做第一步纯化了！

24楼2013-07-24 21:26:15

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24楼: Originally posted by yxncas-2012 at 2013-07-24 21:26:15
这样来看，那个应该是你表达的目的蛋白！
表达的就应该有这样的效果，同时你也要看看分子量是不是接近你的目的蛋白大小。
你测序的时候，测序是不是正确，你的his-tag标签是不是正确加到了你的目的蛋白上面！要是 ...

谢谢，分子量接近我的目的蛋白大小，测序这些都没有问题，就是纯化的时候纯化不到目的条带，不知纯化发酵液中的目的条带您是否有什么好的办法？

25楼2013-07-25 20:58:50

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25楼: Originally posted by liushuizhf at 2013-07-25 20:58:50
谢谢，分子量接近我的目的蛋白大小，测序这些都没有问题，就是纯化的时候纯化不到目的条带，不知纯化发酵液中的目的条带您是否有什么好的办法？...

纯化不到目的条带？是何缘故呢？
不知道你的纯化步骤是如何进行的，我不是很清楚，也不了解你这个是不是包涵体，或者分泌性表达，这些信息我都不了解，所以也给不了你比较具体的帮助！
不过一般情况可以这样来尝试一下，如果你的目的蛋白在菌体中，而且超声或者均质破菌之后，目的蛋白就在上清中了，这样就比较好办了！
可以选择梯度盐析的方法做第一步的初纯，然后Ni柱，这个过程你选择的buffer的pH值一定要选恰当的！
先说这么多吧！你试试看！有问题在联系我！
yxncas@gmail.com，或者18622804318，杨
希望你能顺利完成实验！

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liushuizhf

26楼2013-07-25 22:30:57

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26楼: Originally posted by yxncas-2012 at 2013-07-25 22:30:57
纯化不到目的条带？是何缘故呢？
不知道你的纯化步骤是如何进行的，我不是很清楚，也不了解你这个是不是包涵体，或者分泌性表达，这些信息我都不了解，所以也给不了你比较具体的帮助！
不过一般情况可以这样来尝 ...

我的目的蛋白是直接分泌到发酵液中，以上我跑的蛋白电泳都是用处理发酵液然后跑的蛋白电泳。现在的问题是直接拿发酵液去纯化，总也纯化不到目的片段，并且杂蛋白也特别多，不知道您做过相关纯化没，谢谢！

27楼2013-07-26 12:23:35