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zhangyi05

禁虫 (小有名气)

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21楼2013-07-23 17:04:19
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liushuizhf

铁虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
21楼: Originally posted by zhangyi05 at 2013-07-23 17:04:19
W是野生型?
这么看起来的话应该是表达了。...

W是野生型,真的是表达了吗,那我为什么纯化不到呢,对于纯化发酵液汇中的蛋白您有什么好的建议吗?
22楼2013-07-23 18:11:09
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liushuizhf

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
20楼: Originally posted by lifuzhu3838 at 2013-07-23 15:57:30
我也是菜鸟,不要介意...

相互学习
23楼2013-07-23 18:13:47
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by liushuizhf at 2013-07-22 00:43:24
您好,您提的这个问题特别好,因为之前没有做过此类实验,所以也不太确定应该是什么样的,重新跑的蛋白电泳疑是目的条带挺亮的,但是野生型也有一条比较浅的条带,所以想请您看一下这是不是您说的”比野生型明显多 ...

这样来看,那个应该是你表达的目的蛋白!
表达的就应该有这样的效果,同时你也要看看分子量是不是接近你的目的蛋白大小。
你测序的时候,测序是不是正确,你的his-tag标签是不是正确加到了你的目的蛋白上面!要是这些没有问题,理论上用Ni亲和就很容易做第一步纯化了!
24楼2013-07-24 21:26:15
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liushuizhf

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
24楼: Originally posted by yxncas-2012 at 2013-07-24 21:26:15
这样来看,那个应该是你表达的目的蛋白!
表达的就应该有这样的效果,同时你也要看看分子量是不是接近你的目的蛋白大小。
你测序的时候,测序是不是正确,你的his-tag标签是不是正确加到了你的目的蛋白上面!要是 ...

谢谢,分子量接近我的目的蛋白大小,测序这些都没有问题,就是纯化的时候纯化不到目的条带,不知纯化发酵液中的目的条带您是否有什么好的办法?
25楼2013-07-25 20:58:50
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

引用回帖:
25楼: Originally posted by liushuizhf at 2013-07-25 20:58:50
谢谢,分子量接近我的目的蛋白大小,测序这些都没有问题,就是纯化的时候纯化不到目的条带,不知纯化发酵液中的目的条带您是否有什么好的办法?...

纯化不到目的条带?是何缘故呢?
不知道你的纯化步骤是如何进行的,我不是很清楚,也不了解你这个是不是包涵体,或者分泌性表达,这些信息我都不了解,所以也给不了你比较具体的帮助!
不过一般情况可以这样来尝试一下,如果你的目的蛋白在菌体中,而且超声或者均质破菌之后,目的蛋白就在上清中了,这样就比较好办了!
可以选择梯度盐析的方法做第一步的初纯,然后Ni柱,这个过程你选择的buffer的pH值一定要选恰当的!
先说这么多吧!你试试看!有问题在联系我!
yxncas@gmail.com,或者18622804318,杨
希望你能顺利完成实验!

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

26楼2013-07-25 22:30:57
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liushuizhf

铁虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
26楼: Originally posted by yxncas-2012 at 2013-07-25 22:30:57
纯化不到目的条带?是何缘故呢?
不知道你的纯化步骤是如何进行的,我不是很清楚,也不了解你这个是不是包涵体,或者分泌性表达,这些信息我都不了解,所以也给不了你比较具体的帮助!
不过一般情况可以这样来尝 ...

我的目的蛋白是直接分泌到发酵液中,以上我跑的蛋白电泳都是用处理发酵液然后跑的蛋白电泳。现在的问题是直接拿发酵液去纯化,总也纯化不到目的片段,并且杂蛋白也特别多,不知道您做过相关纯化没,谢谢!
27楼2013-07-26 12:23:35
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M110899

金虫 (正式写手)

楼主有蛋白纯化试剂盒的中文说明书吗?能否方便发我一份?感激不尽
28楼2014-03-20 15:47:44
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liushuizhf

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
28楼: Originally posted by M110899 at 2014-03-20 15:47:44
楼主有蛋白纯化试剂盒的中文说明书吗?能否方便发我一份?感激不尽

我用的是MERCK的说明书,可以直接在网上下载的
29楼2014-03-27 10:55:29
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众星揽月

新虫 (初入文坛)

  顶一下   Engreen
30楼2015-09-07 11:16:33
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