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蛋白表达及纯化
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我现在在做真菌异源表达蛋白，发酵液处理之后跑的电泳见图，多出来的条带应该是我的目的条带，但是通过镍柱纯化不到，不知道是没有表达还是纯化的方法不对，各位有什么好的建议没，着急毕业，请各位帮帮忙! 第一个泳道为maker、第二泳道是野生型、剩下的泳道都是转化子 |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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4楼2013-07-16 21:38:11
凌波丽
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【答案】应助回帖
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kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-07-16 19:12:16
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昨天我正好和别人讨论了类似的问题，把与楼主可能有关的内容贴在这里。 楼主的弥散在目的带邻近的带可能是目的带的蛋白质发生了降解或则异常折叠，甚至于聚合。 建议检测与改进措施如下： 1.你测一下目标条带下的带的蛋白质的红外光谱和紫外光谱，与目的条带对比，如果两者的紫外光谱值明显不同，很可能折叠状态也不同，这是不测分子量的情况直接用光谱就能测定的，有时候折叠状态不同红外光谱也是相同的，因为二级结构未变，但是拓扑结构变了，三级结构也就变了。你在测定不同电泳带的蛋白质可能是折叠状态不一样时的同种蛋白质分子，用红外和紫外光谱很容易，但是首选要确定被研究的样品蛋白质的分子量相同，可以用质谱或者分子筛层析。 2.至于是否有降解，那要对目的条带和非目的条带测定分子量确定两者存在差异的话而后Ediman测序，其他没有好的对比办法。 3.用肽谱分析可能降解的重组蛋白质和目的蛋白质没有用。即用胰蛋白酶（或其他蛋白酶）同样条件下有限水解重组蛋白质和目的蛋白走电泳分析电泳片段，没有太用处，因为同一种蛋白质这的状态不同也可能会掩盖一些原有的酶切位点，何况蛋白质水解后可能引起重折叠或去折叠，所以引起酶切位点的暴露或被掩盖都是可能的。 4.如果想要知道是在转录水平还是翻译水平出的问题，直接检测mRNA的表达水平很麻烦，因为mRNA本身你很不稳定，讲解很快，利用northern测特异的mRNA的的表达水平的结果可能只有参考价值。建议同时在表达系统中添加光谱蛋白酶抑制剂（有现成商品出售），分梯度加入，而后用电泳检测目的蛋白质的含量变化。或者直接构建强启动子，必要的话加上enhancer，调节加强其他的表达的条件，可以使用分泌表达和包涵体，以排除水解的可能，也可以补偿在转录水平的不完全转录的情况，或者包涵体至少纯化起来方便。包涵体复性前可以包裹上滤纸，用锤子将包涵体砸成粉末，这样能够极大的增加包涵体与变形试剂接触的表面积，增大反应速率。 5.建议同时在表达系统中添加光谱蛋白酶抑制剂（有现成商品出售），分梯度加入，而后用电泳检测目的蛋白质的含量变化，只能在粉碎细胞或者分泌表达时进行，在活细胞内不能如此操作，因为很难透过细胞膜，即使透过了对细胞有什么具体影响很难预测. 6.要精确调查出你的目地蛋白质到底是在转录水平不完全还是翻译水平受阻或者翻译后被降解，必须随用细胞外转录和翻译系统，然后分别抑制转录，翻译和蛋白质水解酶。不能对活的工程细胞使用，因为那样还没有出结果，工程细胞先挂了。 7.有时不用找出具体原因，只要能够低成本的放大基因表达体系就行，密码子可以选用偏好密码子。 8.胞内表达可以在同样条件下收活细胞后，在溶液中加入广谱蛋白酶抑制剂和分梯度加入广谱蛋白酶抑制剂，然后在其他同样条件下粉碎细胞，比较目地蛋白质的收率。 镍柱纯化我就不说了。 |
2楼2013-07-16 11:03:43
lijian670417 
铁虫 (初入文坛)
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3楼2013-07-16 17:55:26
5楼2013-07-16 21:40:19
