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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于用Ni-NTA His.bind树脂纯化原核表达蛋白
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你延迟洗脱时间，适当增加洗脱液中咪唑的浓度，
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11楼2012-03-16 11:20:34
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sdxianwei

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不知道你得具体操作是怎样的，你是不是做了一个柱上复性？
如果是柱上复性，那你的样品挂在层析柱上后，需要一个复性过程，让你得蛋白折叠到天然构象，一般这个过程是通过缓慢降低尿素的浓度来实现，时间大于12小时，分子量越大，复性时间一般稍长，因为空间结构越复杂。
如果你上样后直接洗脱，是起不到复性效果的，这样会使蛋白瞬间折叠成杂乱状态，正确结构很少。
建议上样后走个尿素梯度6M-0M，其他成分与上样缓冲液一样
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小木虫
12楼2012-03-16 12:53:42
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brown437

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by linatracy at 2012-03-15 16:09:27:
洗涤的时候，应该做一个梯度洗涤！我现在在纯化的蛋白，用10mM，20mM，40mM，80mM......400mM,到时候可以看出后面洗脱的蛋白很纯，自己选择一个合适的洗涤液。我到300mM的洗脱液就洗脱的很干净，一遍就基本干净了 ...

那是不是最后的蛋白量就少了很多？我是在250nM条件下洗了多次，最后一次目的蛋白是比较纯了，但是量太少了，后来觉得是不是洗脱时间也不易太长，不知道你的洗脱时间是怎么控制的？
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13楼2012-04-28 16:03:10
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linatracy

金虫 (小有名气)
你做梯度洗涤之后，跑电泳之后，看看在那个浓度的是目的蛋白是不会洗下来的，选择一个最大浓度做洗涤液，后面在选择一个合适的浓度在做洗脱液，就可以了！之后再接洗脱下来的蛋白，跑电泳，我是用的2ml柱子，洗三遍差不多就可以了，后面在洗的就不要了，量太低了。
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14楼2012-04-28 17:10:29
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)
其实可以做一些前处理，比如做一步盐析，除掉一部分杂蛋白之后再来纯化！那样可能效果会好一些
！
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15楼2012-12-01 16:21:17
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M110899

金虫 (正式写手)
l楼主有没有蛋白纯化试剂盒的中文说明书？能否方便发我一份？感激不尽
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16楼2014-03-20 15:49:17
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夏至1990

金虫 (小有名气)

小小虫
引用回帖:
9楼: Originally posted by 18853850850 at 2012-02-16 09:11:53
蛋白小好纯化一点吧，我的一个30KD的蛋白就纯化的不错...

楼主方便额告知下我吗，我也在纯化个35kd左右的 蛋白，总是有杂蛋白啊
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Sodoyouwanttotakealeapoffaith…orbecomeanoldman,filledwithregret…waitingtodiealone?
17楼2014-03-28 14:59:49
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