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whb21

木虫 (著名写手)

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专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

建议你延迟洗脱时间，适当增加洗脱液中咪唑的浓度，

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11楼2012-03-16 11:20:34

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sdxianwei

木虫 (小有名气)

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专业: 微生物资源与分类学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

不知道你得具体操作是怎样的，你是不是做了一个柱上复性？
如果是柱上复性，那你的样品挂在层析柱上后，需要一个复性过程，让你得蛋白折叠到天然构象，一般这个过程是通过缓慢降低尿素的浓度来实现，时间大于12小时，分子量越大，复性时间一般稍长，因为空间结构越复杂。
如果你上样后直接洗脱，是起不到复性效果的，这样会使蛋白瞬间折叠成杂乱状态，正确结构很少。
建议上样后走个尿素梯度6M-0M，其他成分与上样缓冲液一样

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小木虫

12楼2012-03-16 12:53:42

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brown437

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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注册: 2012-02-04
专业: 生物化学

引用回帖:

10楼: Originally posted by linatracy at 2012-03-15 16:09:27:
洗涤的时候，应该做一个梯度洗涤！我现在在纯化的蛋白，用10mM，20mM，40mM，80mM......400mM,到时候可以看出后面洗脱的蛋白很纯，自己选择一个合适的洗涤液。我到300mM的洗脱液就洗脱的很干净，一遍就基本干净了 ...

那是不是最后的蛋白量就少了很多？我是在250nM条件下洗了多次，最后一次目的蛋白是比较纯了，但是量太少了，后来觉得是不是洗脱时间也不易太长，不知道你的洗脱时间是怎么控制的？

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13楼2012-04-28 16:03:10

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