应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于用Ni-NTA His.bind树脂纯化原核表达蛋白
52/1返回列表
查看: 3557  |  回复: 16
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

18853850850

金虫 (正式写手)

[求助] 关于用Ni-NTA His.bind树脂纯化原核表达蛋白

图在图片上传中...
问题I：蛋白明显不纯，有大量蛋白存在于最终Elute Buffer中，大部分蛋白小于目的蛋白（约70KD）；
问题II：Bind Buffer中，目的蛋白含量较高，这个可能是结合树脂用量不够，或可能是带6*His标签的不完全表达短蛋白占据大量结合位点，如果真有此问题，应该怎样去解决？
问题III：Wash buffer 起不到洗脱杂蛋白的作用，基中含有杂蛋白很少，倒有少部分是目的蛋白;
问题IV：含总蛋白量大的管（图中3）中蛋白很快析出，不知如何去溶解，没有办法保存。

SDS-PAGE电流图
回复此楼

» 猜你喜欢
学自己想知道的
1楼2012-02-13 16:29:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sdxianwei

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不知道你得具体操作是怎样的，你是不是做了一个柱上复性？
如果是柱上复性，那你的样品挂在层析柱上后，需要一个复性过程，让你得蛋白折叠到天然构象，一般这个过程是通过缓慢降低尿素的浓度来实现，时间大于12小时，分子量越大，复性时间一般稍长，因为空间结构越复杂。
如果你上样后直接洗脱，是起不到复性效果的，这样会使蛋白瞬间折叠成杂乱状态，正确结构很少。
建议上样后走个尿素梯度6M-0M，其他成分与上样缓冲液一样
赞一下 回复此楼
小木虫
12楼2012-03-16 12:53:42
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答

qjy_134

铜虫 (小有名气)
amisking(金币+3): 鼓励积极应助！ 2012-02-13 19:52:52
第一，你柱介质用的少一点，一般1ml 柱介质可以纯化10mg的靶蛋白
第二，靶蛋白没有完全挂上去，你到时候加固体尿素，终浓度搞到8M
第三，你是用什么溶液把蛋白洗脱下来的
第四，你纯化蛋白什么目的
赞一下 回复此楼
2楼2012-02-13 16:38:12
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18853850850

金虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by qjy_134 at 2012-02-13 16:38:12:
第一，你柱介质用的少一点，一般1ml 柱介质可以纯化10mg的靶蛋白
第二，靶蛋白没有完全挂上去，你到时候加固体尿素，终浓度搞到8M
第三，你是用什么溶液把蛋白洗脱下来的
第四，你纯化蛋白什么目的

1 .说明书上是这样说的，但明显是有相当一部分的目的蛋白没有结合上柱子；
2.Wash buffer是50mM NaH2PO4,300mM NaCl,20mM 咪唑，pH8.0;
3 Elute buffer是50mM NaH2PO4,300mM NaCl,250mM 咪唑pH8.0;
4.在天然条件下纯化，后面液体都不含有尿素；
5.纯化用来作抗原。
赞一下 回复此楼
学自己想知道的
3楼2012-02-13 17:06:35
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
18853850850(金币+5): 2012-02-14 13:36:57
你是镍柱变性纯化，洗脱还是要加变性剂的，直接洗没那么容易复性。然后好像纯化前后没太大区别，非特异性结合太多，你可以把pH降到7.0或6.0试试。
赞一下 回复此楼
关注我关注的
4楼2012-02-13 22:23:29
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭