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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于用Ni-NTA His.bind树脂纯化原核表达蛋白
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18853850850

金虫 (正式写手)

[求助] 关于用Ni-NTA His.bind树脂纯化原核表达蛋白

图在图片上传中...
问题I：蛋白明显不纯，有大量蛋白存在于最终Elute Buffer中，大部分蛋白小于目的蛋白（约70KD）；
问题II：Bind Buffer中，目的蛋白含量较高，这个可能是结合树脂用量不够，或可能是带6*His标签的不完全表达短蛋白占据大量结合位点，如果真有此问题，应该怎样去解决？
问题III：Wash buffer 起不到洗脱杂蛋白的作用，基中含有杂蛋白很少，倒有少部分是目的蛋白;
问题IV：含总蛋白量大的管（图中3）中蛋白很快析出，不知如何去溶解，没有办法保存。

SDS-PAGE电流图
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学自己想知道的
1楼2012-02-13 16:29:46
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brown437

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by linatracy at 2012-03-15 16:09:27:
洗涤的时候，应该做一个梯度洗涤！我现在在纯化的蛋白，用10mM，20mM，40mM，80mM......400mM,到时候可以看出后面洗脱的蛋白很纯，自己选择一个合适的洗涤液。我到300mM的洗脱液就洗脱的很干净，一遍就基本干净了 ...

那是不是最后的蛋白量就少了很多？我是在250nM条件下洗了多次，最后一次目的蛋白是比较纯了，但是量太少了，后来觉得是不是洗脱时间也不易太长，不知道你的洗脱时间是怎么控制的？
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13楼2012-04-28 16:03:10
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qjy_134

铜虫 (小有名气)
amisking(金币+3): 鼓励积极应助！ 2012-02-13 19:52:52
第一，你柱介质用的少一点，一般1ml 柱介质可以纯化10mg的靶蛋白
第二，靶蛋白没有完全挂上去，你到时候加固体尿素，终浓度搞到8M
第三，你是用什么溶液把蛋白洗脱下来的
第四，你纯化蛋白什么目的
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2楼2012-02-13 16:38:12
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18853850850

金虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by qjy_134 at 2012-02-13 16:38:12:
第一，你柱介质用的少一点，一般1ml 柱介质可以纯化10mg的靶蛋白
第二，靶蛋白没有完全挂上去，你到时候加固体尿素，终浓度搞到8M
第三，你是用什么溶液把蛋白洗脱下来的
第四，你纯化蛋白什么目的

1 .说明书上是这样说的，但明显是有相当一部分的目的蛋白没有结合上柱子；
2.Wash buffer是50mM NaH2PO4,300mM NaCl,20mM 咪唑，pH8.0;
3 Elute buffer是50mM NaH2PO4,300mM NaCl,250mM 咪唑pH8.0;
4.在天然条件下纯化，后面液体都不含有尿素；
5.纯化用来作抗原。
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学自己想知道的
3楼2012-02-13 17:06:35
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zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
18853850850(金币+5): 2012-02-14 13:36:57
你是镍柱变性纯化，洗脱还是要加变性剂的，直接洗没那么容易复性。然后好像纯化前后没太大区别，非特异性结合太多，你可以把pH降到7.0或6.0试试。
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关注我关注的
4楼2012-02-13 22:23:29
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