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jinkui960

至尊木虫 (知名作家)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-07-30 23:05:53
btx362237729(金币+2): 非常感谢哦。。。。。但是过夜透析怎么换液，，，半夜换啊 2011-07-31 12:53:14

引用回帖:

Originally posted by btx362237729 at 2011-07-30 20:22:31:

以前没纯化过蛋白，听说透析的时候要加PMSF，我查了一下PMSF是抑制蛋白酶的，应该是防止目的蛋白被降解咯。。。。。

而且PMSF有剧毒啊。。。

请问PMSF的量应该是加多少啊？
还有透析的时间大概是多 ...

PMSF是丝氨酸蛋白酶的专一性抑制剂，主要是防止目的蛋白在纯化的过程中被降解。
PMSF虽然有毒，但操作过程中戴手套，操作过程中小心一点，没有问题的。

PMSF的用量很少，以前我的实验结果表明1mM浓度的PMSF就可以抑制住丝氨酸蛋白酶的活性。

透析的时间一般是7-8个小时，也可以过夜透析，如果蛋白容易变性，最好在冰浴或4度透析，透析缓冲液要换3-4次。

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6楼2011-07-30 21:57:52

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jinkui960

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【答案】应助回帖

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西瓜(金币+3, MolEPI+1): Good! 2011-07-31 14:17:02

引用回帖:

10楼: Originally posted by btx362237729 at 2011-07-31 13:16:43:
但是缓冲液中有Tris 有EDTA。。。透析就是为了除掉这些盐。。。肯定不能用缓冲液啊

不一定呀，比如我的蛋白是经过硫酸铵沉淀以后溶解在磷酸盐缓冲液中，为了去除蛋白溶液中的过多的硫酸铵，我可以通过磷酸盐缓冲液进行透析，使硫酸铵逐渐被透析出去。

如果你的蛋白溶解在含有Tris 和EDTA的缓冲液中，你也可以利用从高到低浓度的Tris 缓冲液进行透析，比如你的蛋白最开始使溶解在20mM的Tris 缓冲液中，透析的时候可以采用梯度透析，先用10mM的Tris 缓冲液透析2-3小时，再用5mM的Tris 缓冲液透析2-3小时，最后用无菌纯水进行透析2-3小时，即可。

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11楼2011-07-31 13:25:31

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