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shizhuang1985

金虫 (小有名气)

甘油,或者少量triton助溶效果很明显。
11楼2011-11-17 22:21:22
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allmessup

铜虫 (初入文坛)

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励新朋友回帖! 2011-11-18 19:28:45
引用回帖:
10楼: Originally posted by torontogirl at 2011-11-17 15:50:11:
引用的文献就更不会写的详细了,我看了好多篇都是一笔带过的。

还有如果是published online的文章,可以看一看有没有support information~
那个里面也有很多实验方法的细节~
Ipsascientiapotestasest.
12楼2011-11-17 23:26:01
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torontogirl

铁虫 (初入文坛)

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): Good!鼓励应助! 2011-11-18 19:29:38
引用回帖:
11楼: Originally posted by shizhuang1985 at 2011-11-17 22:21:22:
甘油,或者少量triton助溶效果很明显。

恩,甘油我试过,会助溶,可是有一个问题,会严重影响蛋白定量,我们采用BCA试剂盒进行蛋白定量,用其它方法怕蛋白定量不准。
13楼2011-11-18 08:17:58
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torontogirl

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by allmessup at 2011-11-17 23:26:01:
还有如果是published online的文章,可以看一看有没有support information~
那个里面也有很多实验方法的细节~

好的,谢谢。我在一篇文献中看到最后溶解的缓冲液是50mM Tris-HCl,300mM NaCl,1mMTECP,我试过,蛋白浓度也没达到1mg/ml。重新再做一遍看看吧。
14楼2011-11-18 08:24:03
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shizhuang1985

金虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by torontogirl at 2011-11-18 08:17:58:
恩,甘油我试过,会助溶,可是有一个问题,会严重影响蛋白定量,我们采用BCA试剂盒进行蛋白定量,用其它方法怕蛋白定量不准。

你做大分子结构?
哪个课题组?
我觉得每次你用同样的方法就可以,能够保证实验的可重复性就足够了。
很多结构文章上methods里提到,他们定量蛋白都是使用测量280nm处的吸收。
15楼2011-11-18 08:47:05
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torontogirl

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
15楼: Originally posted by shizhuang1985 at 2011-11-18 08:47:05:
你做大分子结构?
哪个课题组?
我觉得每次你用同样的方法就可以,能够保证实验的可重复性就足够了。
很多结构文章上methods里提到,他们定量蛋白都是使用测量280nm处的吸收。

没有,我是做药物的,用280来定量,一定需要蛋白很纯吧。
16楼2011-11-18 19:22:19
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torontogirl

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
16楼: Originally posted by torontogirl at 2011-11-18 19:22:19:
没有,我是做药物的,用280来定量,一定需要蛋白很纯吧。

做药物与蛋白相互作用。呵呵。
17楼2011-11-18 19:23:16
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allmessup

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
16楼: Originally posted by torontogirl at 2011-11-18 19:22:19:
没有,我是做药物的,用280来定量,一定需要蛋白很纯吧。

的确,定的是蛋白总量~所以也要和HPLC啊胶啊什么的结合起来看~
不过用nanodrop这货在280定量的确是挺方便的~

一般做大分子结构的都要长晶体啊NMR什么的~蛋白势必会很纯,所以这个应该不是太过在意的东西吧。如果是蛋白质组的话就非要用质谱不可了……
Ipsascientiapotestasest.
18楼2011-11-20 00:18:31
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torontogirl

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
18楼: Originally posted by allmessup at 2011-11-20 00:18:31:
的确,定的是蛋白总量~所以也要和HPLC啊胶啊什么的结合起来看~
不过用nanodrop这货在280定量的确是挺方便的~

一般做大分子结构的都要长晶体啊NMR什么的~蛋白势必会很纯,所以这个应该不是太过在意的东西吧。 ...

恩,目前我只是做活性实验,所以纯度不用太高。
19楼2011-11-21 21:07:44
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月月大可

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 有经验的高手啊! 2011-12-13 18:54:43
引用回帖:
1楼: Originally posted by torontogirl at 2011-11-15 15:31:39:
我最近在做AMPK的蛋白纯化,用的是原核表达,诱导表达的大部分目的蛋白都是包涵体,小部分是可溶的。我就利用这小部分的可溶蛋白过了两次His亲和层析柱,纯化出来的纯度大概在85%以上,可惜在浓缩的时候出现大量沉 ...

把你的小分子底物加进去,或者加一些蛋白的底物。这种东西对蛋白的结构稳定非常之重要。
两年前我接手的一个蛋白,原核表达量非常大,但是一旦从镍柱上洗脱后,4度过夜就沉淀。后来加入该蛋白的底物,冰箱里最久放过两个星期都没问题。

尝试一下吧。
20楼2011-12-13 16:40:39
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