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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » AMPK蛋白纯化问题讨论
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shizhuang1985

金虫 (小有名气)
甘油，或者少量triton助溶效果很明显。
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11楼2011-11-17 22:21:22
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allmessup

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励新朋友回帖！ 2011-11-18 19:28:45
引用回帖:
10楼: Originally posted by torontogirl at 2011-11-17 15:50:11:
引用的文献就更不会写的详细了，我看了好多篇都是一笔带过的。

还有如果是published online的文章，可以看一看有没有support information~
那个里面也有很多实验方法的细节~
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Ipsascientiapotestasest.
12楼2011-11-17 23:26:01
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torontogirl

铁虫 (初入文坛)
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): Good！鼓励应助！ 2011-11-18 19:29:38
引用回帖:
11楼: Originally posted by shizhuang1985 at 2011-11-17 22:21:22:
甘油，或者少量triton助溶效果很明显。

恩，甘油我试过，会助溶，可是有一个问题，会严重影响蛋白定量，我们采用BCA试剂盒进行蛋白定量，用其它方法怕蛋白定量不准。
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13楼2011-11-18 08:17:58
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torontogirl

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by allmessup at 2011-11-17 23:26:01:
还有如果是published online的文章，可以看一看有没有support information~
那个里面也有很多实验方法的细节~

好的，谢谢。我在一篇文献中看到最后溶解的缓冲液是50mM Tris-HCl，300mM NaCl，1mMTECP，我试过，蛋白浓度也没达到1mg/ml。重新再做一遍看看吧。
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14楼2011-11-18 08:24:03
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shizhuang1985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by torontogirl at 2011-11-18 08:17:58:
恩，甘油我试过，会助溶，可是有一个问题，会严重影响蛋白定量，我们采用BCA试剂盒进行蛋白定量，用其它方法怕蛋白定量不准。

你做大分子结构？
哪个课题组？
我觉得每次你用同样的方法就可以，能够保证实验的可重复性就足够了。
很多结构文章上methods里提到，他们定量蛋白都是使用测量280nm处的吸收。
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15楼2011-11-18 08:47:05
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torontogirl

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by shizhuang1985 at 2011-11-18 08:47:05:
你做大分子结构？
哪个课题组？
我觉得每次你用同样的方法就可以，能够保证实验的可重复性就足够了。
很多结构文章上methods里提到，他们定量蛋白都是使用测量280nm处的吸收。

没有，我是做药物的，用280来定量，一定需要蛋白很纯吧。
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16楼2011-11-18 19:22:19
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torontogirl

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by torontogirl at 2011-11-18 19:22:19:
没有，我是做药物的，用280来定量，一定需要蛋白很纯吧。

做药物与蛋白相互作用。呵呵。
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17楼2011-11-18 19:23:16
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allmessup

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by torontogirl at 2011-11-18 19:22:19:
没有，我是做药物的，用280来定量，一定需要蛋白很纯吧。

的确，定的是蛋白总量~所以也要和HPLC啊胶啊什么的结合起来看~
不过用nanodrop这货在280定量的确是挺方便的~

一般做大分子结构的都要长晶体啊NMR什么的~蛋白势必会很纯，所以这个应该不是太过在意的东西吧。如果是蛋白质组的话就非要用质谱不可了……
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Ipsascientiapotestasest.
18楼2011-11-20 00:18:31
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torontogirl

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
18楼: Originally posted by allmessup at 2011-11-20 00:18:31:
的确，定的是蛋白总量~所以也要和HPLC啊胶啊什么的结合起来看~
不过用nanodrop这货在280定量的确是挺方便的~

一般做大分子结构的都要长晶体啊NMR什么的~蛋白势必会很纯，所以这个应该不是太过在意的东西吧。 ...

恩，目前我只是做活性实验，所以纯度不用太高。
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19楼2011-11-21 21:07:44
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月月大可

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 有经验的高手啊！ 2011-12-13 18:54:43
引用回帖:
1楼: Originally posted by torontogirl at 2011-11-15 15:31:39:
我最近在做AMPK的蛋白纯化，用的是原核表达，诱导表达的大部分目的蛋白都是包涵体，小部分是可溶的。我就利用这小部分的可溶蛋白过了两次His亲和层析柱，纯化出来的纯度大概在85%以上，可惜在浓缩的时候出现大量沉 ...

把你的小分子底物加进去，或者加一些蛋白的底物。这种东西对蛋白的结构稳定非常之重要。
两年前我接手的一个蛋白，原核表达量非常大，但是一旦从镍柱上洗脱后，4度过夜就沉淀。后来加入该蛋白的底物，冰箱里最久放过两个星期都没问题。

尝试一下吧。
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20楼2011-12-13 16:40:39
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