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[交流]
β-糖苷酶表达可溶性蛋白很多，怎么就是没有活性
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| 最近表达几个β-糖苷酶基因（pet载体，BL21DE3），目的基因可溶性蛋白很多，也经过镍柱纯化了，蛋白电泳也跑了，都没什么问题，但就是在用pNP-G测活性时，都没活性，包括裂解全菌液，上清，纯化后的蛋白。酶活测定的条件是：醋酸钠缓冲液（ph 4, 4.5, 5, 7.0都试了）50ul+400ul水+15ulpNP-G +酶液。37度水浴几个小时也没反应。 大家指点下吧，是哪里有问题，谢谢了 |
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3楼2011-12-04 16:18:17
2楼2011-12-04 14:55:57
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zhang8826857(金币+2): good，鼓励热心虫子 2011-12-04 18:11:46
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zhang8826857(金币+2): good，鼓励热心虫子 2011-12-04 18:11:46
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1.原核表达出来的蛋白往往缺乏正确的折叠 没有糖基化 即使不是包涵体也很难会有活性 如果你相信是包涵体的问题 你可以用16度低温过夜表达 看看有没有活性 2.糖苷酶很多人表达都是用酵母的 3.关于测活 我记得是最后用碳酸钠或氢氧化钠等碱性物质终止反应 在碱性条件下pNP才显黄色 4. 你的酶英文名叫什么？beta-glucosidase?最适反映温度应该是40度以上 [ Last edited by MaoNaiJi on 2011-12-4 at 17:26 ] |
4楼2011-12-04 17:24:27
6楼2011-12-04 18:02:24