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Shinning123

新虫 (初入文坛)


[交流] β-糖苷酶表达可溶性蛋白很多,怎么就是没有活性

最近表达几个β-糖苷酶基因(pet载体,BL21DE3),目的基因可溶性蛋白很多,也经过镍柱纯化了,蛋白电泳也跑了,都没什么问题,但就是在用pNP-G测活性时,都没活性,包括裂解全菌液,上清,纯化后的蛋白。酶活测定的条件是:醋酸钠缓冲液(ph 4, 4.5,  5,  7.0都试了)50ul+400ul水+15ulpNP-G +酶液。37度水浴几个小时也没反应。 大家指点下吧,是哪里有问题,谢谢了
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Shinning123

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
4楼: Originally posted by MaoNaiJi at 2011-12-04 17:24:27:
1.原核表达出来的蛋白往往缺乏正确的折叠 没有糖基化 即使不是包涵体也很难会有活性 如果你相信是包涵体的问题 你可以用16度低温过夜表达 看看有没有活性
2.糖苷酶很多人表达都是用酵母的
3.关于测活 我记 ...

是beta-glucosidase,我的反应温度在37,应该差不多吧,pNP-G不用在碱性下才显示吧,它是被水解后产生的pNP才显黄色的呀,我以前做脂肪酶的也是这样反应就行了,没有碱性终止。只不过我在纯化和透析过程中用的是ph8的Tris-Hcl缓冲液,还有这个酶先有人也是这样表达出来有活性的,到我这表达就酶活性了
6楼2011-12-04 18:02:24
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MaoNaiJi

金虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
原核表达酶没有活性太正常了 你有毕赤酵母做就不一样了
2楼2011-12-04 14:55:57
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Shinning123

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
2楼: Originally posted by MaoNaiJi at 2011-12-04 14:55:57:
原核表达酶没有活性太正常了 你有毕赤酵母做就不一样了

它没活性应该就是包涵体表达吧,那怎么会都是可溶性的蛋白呢,我有些怀疑是不是酶活测定条件有问题?
3楼2011-12-04 16:18:17
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MaoNaiJi

金虫 (正式写手)


★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
zhang8826857(金币+2): good,鼓励热心虫子 2011-12-04 18:11:46
引用回帖:
3楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-04 16:18:17:
它没活性应该就是包涵体表达吧,那怎么会都是可溶性的蛋白呢,我有些怀疑是不是酶活测定条件有问题?

1.原核表达出来的蛋白往往缺乏正确的折叠 没有糖基化 即使不是包涵体也很难会有活性 如果你相信是包涵体的问题 你可以用16度低温过夜表达 看看有没有活性
2.糖苷酶很多人表达都是用酵母的
3.关于测活 我记得是最后用碳酸钠或氢氧化钠等碱性物质终止反应
在碱性条件下pNP才显黄色
4. 你的酶英文名叫什么?beta-glucosidase?最适反映温度应该是40度以上

[ Last edited by MaoNaiJi on 2011-12-4 at 17:26 ]
4楼2011-12-04 17:24:27
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