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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » β-糖苷酶表达可溶性蛋白很多，怎么就是没有活性
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Shinning123

新虫 (初入文坛)

[交流] β-糖苷酶表达可溶性蛋白很多，怎么就是没有活性

最近表达几个β-糖苷酶基因（pet载体，BL21DE3），目的基因可溶性蛋白很多，也经过镍柱纯化了，蛋白电泳也跑了，都没什么问题，但就是在用pNP-G测活性时，都没活性，包括裂解全菌液，上清，纯化后的蛋白。酶活测定的条件是：醋酸钠缓冲液（ph 4, 4.5,  5,  7.0都试了）50ul+400ul水+15ulpNP-G +酶液。37度水浴几个小时也没反应。 大家指点下吧，是哪里有问题，谢谢了
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1楼 2011-12-04 13:45:44
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MaoNaiJi

金虫 (正式写手)
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amisking(金币+3): 鼓励发帖交流。 2011-12-04 18:54:06
Shinning123(金币+5): 2011-12-04 22:54:19
pNPG是邻（对）-硝基苯酚葡萄糖苷，被β-葡萄糖苷酶水解后生产pNP,
pNP在碱性条件下才显黄色！！ 显色之后才可以测吸光值，换算成酶活。
我以前就是做纤维素酶的，β-葡萄糖苷酶最适温度通常是40-50度，有的更高。另外 脂肪酶和这个有关么？无关吧！
关于表达，你可以尝试低温过夜表达，然后超声破碎沉淀，包涵体可以用尿素复活。详细的自己查资料了。
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7楼2011-12-04 18:31:41
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MaoNaiJi

金虫 (正式写手)
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原核表达酶没有活性太正常了 你有毕赤酵母做就不一样了
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2楼2011-12-04 14:55:57
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Shinning123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by MaoNaiJi at 2011-12-04 14:55:57:
原核表达酶没有活性太正常了 你有毕赤酵母做就不一样了

它没活性应该就是包涵体表达吧，那怎么会都是可溶性的蛋白呢，我有些怀疑是不是酶活测定条件有问题？
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3楼2011-12-04 16:18:17
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MaoNaiJi

金虫 (正式写手)
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zhang8826857(金币+2): good，鼓励热心虫子 2011-12-04 18:11:46
引用回帖:
3楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-04 16:18:17:
它没活性应该就是包涵体表达吧，那怎么会都是可溶性的蛋白呢，我有些怀疑是不是酶活测定条件有问题？

1.原核表达出来的蛋白往往缺乏正确的折叠 没有糖基化 即使不是包涵体也很难会有活性 如果你相信是包涵体的问题 你可以用16度低温过夜表达 看看有没有活性
2.糖苷酶很多人表达都是用酵母的
3.关于测活 我记得是最后用碳酸钠或氢氧化钠等碱性物质终止反应
在碱性条件下pNP才显黄色
4. 你的酶英文名叫什么？beta-glucosidase?最适反映温度应该是40度以上

[ Last edited by MaoNaiJi on 2011-12-4 at 17:26 ]
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4楼2011-12-04 17:24:27
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Shinning123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by MaoNaiJi at 2011-12-04 17:24:27:
1.原核表达出来的蛋白往往缺乏正确的折叠 没有糖基化 即使不是包涵体也很难会有活性 如果你相信是包涵体的问题 你可以用16度低温过夜表达 看看有没有活性
2.糖苷酶很多人表达都是用酵母的
3.关于测活 我记 ...

是beta-glucosidase，我的反应温度在37，应该差不多吧，pNP-G不用在碱性下才显示吧，它是被水解后产生的pNP才显黄色的呀，我以前做脂肪酶的也是这样反应就行了，没有碱性终止。只不过我在纯化和透析过程中用的是ph8的Tris-Hcl缓冲液，还有这个酶先有人也是这样表达出来有活性的，到我这表达就酶活性了
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6楼2011-12-04 18:02:24
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
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zhang8826857(金币+4): 专家就是不一样啊…… 2011-12-04 21:22:13
Shinning123(金币+2): 2011-12-04 23:02:03
引用回帖:
1楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-04 13:45:44:
最近表达几个β-糖苷酶基因（pet载体，BL21DE3），目的基因可溶性蛋白很多，也经过镍柱纯化了，蛋白电泳也跑了，都没什么问题，但就是在用pNP-G测活性时，都没活性，包括裂解全菌液，上清，纯化后的蛋白。酶活测定 ...

纤维二糖水解酶？为何不先用含七叶苷的平板检测有没有活性？既然没有活性，为什么还纯化？没有活性的东西，纯化之后也是没有活性的。如果表达重组菌株在平板培养过程中不能使菌落及菌落附近变黑，那就是有问题，你的重组质粒转化之后有没有用平板筛选阳性转化子，不会是转化之后就直接液体培养，然后吭哧吭哧的纯化去了？

测定酶活性的温度没有问题，05年我做过宏基因组文库，大肠杆菌培养和平板显色我都是用37度的，我筛选得到多个阳性克隆了。关于表达，我没有做这个酶，只是做了5个其它的纤维素酶基因，我觉得BL21(DE3)是没问题的，我唯一怀疑的就是基因在PCR的过程中突变了，可能是点突变，移码基本上不可能。
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8楼2011-12-04 21:11:52
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Shinning123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-12-04 21:11:52:
纤维二糖水解酶？为何不先用含七叶苷的平板检测有没有活性？既然没有活性，为什么还纯化？没有活性的东西，纯化之后也是没有活性的。如果表达重组菌株在平板培养过程中不能使菌落及菌落附近变黑，那就是有问题， ...

谢谢你的回复，七叶苷的筛选方法我之前也做过。这个酶我是接手过来的，老板说先前表达是有活性的，但我和我师弟两个人都做了，还是没酶活。谢谢你的建议，我们准备七叶苷平板试试，再确认下
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9楼2011-12-04 23:01:45
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
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先确认重组菌株的情况再做，导师的话不一定全对，因为之前的人可能为了毕业做了手脚。万事谨慎，不然会费冤枉事。
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10楼2011-12-04 23:43:58
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wanglei512

金虫 (正式写手)
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用buffer将菌体细胞重悬后，高浓度溶菌酶处理30min-1h
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11楼2011-12-05 19:23:26
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Shinning123

新虫 (初入文坛)
Shinning123: 回帖置顶 2011-12-05 21:15:09
谢谢各位的建议，问题已经解决了
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FPshuicao
12楼2011-12-05 21:15:02
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ghs25372216

禁虫 (正式写手)
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13楼2012-04-15 21:40:22
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ghs25372216

禁虫 (正式写手)
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14楼2012-04-15 21:42:43
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ghs25372216

禁虫 (正式写手)
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15楼2012-04-15 21:46:45
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肖-洋

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-12-04 21:11:52
纤维二糖水解酶？为何不先用含七叶苷的平板检测有没有活性？既然没有活性，为什么还纯化？没有活性的东西，纯化之后也是没有活性的。如果表达重组菌株在平板培养过程中不能使菌落及菌落附近变黑，那就是有问题，你 ...

我用七叶苷培养基上滴上纯的β-D-葡萄糖苷酶酶液，都没有出现培养基变黑的现象，这是怎么回事呢，想请教一下，谢谢
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16楼2013-03-22 16:26:35
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肖-洋

新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-04 23:01:45
谢谢你的回复，七叶苷的筛选方法我之前也做过。这个酶我是接手过来的，老板说先前表达是有活性的，但我和我师弟两个人都做了，还是没酶活。谢谢你的建议，我们准备七叶苷平板试试，再确认下...

我用七叶苷培养基上滴上纯的β-D-葡萄糖苷酶酶液，都没有出现培养基变黑的现象，这是怎么回事呢，想请教一下，谢谢
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17楼2013-03-22 16:26:49
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
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16楼: Originally posted by 肖-洋 at 2013-03-22 16:26:35
我用七叶苷培养基上滴上纯的β-D-葡萄糖苷酶酶液，都没有出现培养基变黑的现象，这是怎么回事呢，想请教一下，谢谢...

http://www.cnki.net/kcms/detail/ ... jgrb1FMQUhxeGgwPQ==

封毅.jpg
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18楼2013-03-22 22:52:38
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肖-洋

新虫 (初入文坛)
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18楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-03-22 22:52:38
http://www.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CDFD&QueryID=0&CurRec=2&dbname=CDFD0911&filename=2007142568.nh&uid=WEEvREcwSlJHSldRa1FhdlZYL0tUZTU1ZUhxMm5UbFdGMGVTV1phOVhMdUwy ...

我的培养基含有0.1%七叶苷，0.03%的Fecl3，0.67%的YNB，然后滴上来自于苦杏仁中的纯的β-D-葡萄糖苷酶的纯酶液，就是观察不到培养基上出现黑色晕圈的现象，想请问一下原因？谢谢
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19楼2013-03-28 21:10:17
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Hannet

金虫 (正式写手)
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12楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-05 21:15:02
谢谢各位的建议，问题已经解决了

楼主，我也遇到同样的问题，问题是怎么解决呢？谢谢?
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20楼2013-11-18 17:58:56
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dewdan

新虫 (初入文坛)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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12楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-05 21:15:02
谢谢各位的建议，问题已经解决了

求解决方法啊 我也在做葡萄糖苷酶，但是测不出酶活
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21楼2013-11-20 09:41:55
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LostParasite

新虫 (初入文坛)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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12楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-05 21:15:02
谢谢各位的建议，问题已经解决了

楼主你好，请问你是怎么解决糖苷酶没酶活的问题的呢？

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22楼2019-05-04 06:56:10
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LostParasite

新虫 (初入文坛)
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21楼: Originally posted by dewdan at 2013-11-20 09:41:55
求解决方法啊 我也在做葡萄糖苷酶，但是测不出酶活...

你好，请问后来问题解决了吗？

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23楼2019-05-04 06:56:25
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LostParasite

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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4楼: Originally posted by MaoNaiJi at 2011-12-04 17:24:27
1.原核表达出来的蛋白往往缺乏正确的折叠 没有糖基化 即使不是包涵体也很难会有活性 如果你相信是包涵体的问题 你可以用16度低温过夜表达 看看有没有活性
2.糖苷酶很多人表达都是用酵母的
3.关于测活 我记得 ...

前辈，我也是做β糖苷酶工程菌的，同样诱导后没有酶活，卡在这步挺久了，望指点我一下。

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24楼2019-05-04 07:12:13
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FPshuicao

金虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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12楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-05 21:15:02
谢谢各位的建议，问题已经解决了

前辈，我现在正在做β-葡萄糖醛酸苷酶的稳定性研究，但是酶稳定性很差，低浓度4℃条件下一天就降解失活了，有什么方法可以保持酶活性吗？
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25楼2019-05-21 19:57:50
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harbor20105楼
2011-12-04 17:43   回复  
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