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[交流]
β-糖苷酶表达可溶性蛋白很多，怎么就是没有活性
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| 最近表达几个β-糖苷酶基因（pet载体，BL21DE3），目的基因可溶性蛋白很多，也经过镍柱纯化了，蛋白电泳也跑了，都没什么问题，但就是在用pNP-G测活性时，都没活性，包括裂解全菌液，上清，纯化后的蛋白。酶活测定的条件是：醋酸钠缓冲液（ph 4, 4.5, 5, 7.0都试了）50ul+400ul水+15ulpNP-G +酶液。37度水浴几个小时也没反应。 大家指点下吧，是哪里有问题，谢谢了 |
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zhang8826857(金币+4): 专家就是不一样啊…… 2011-12-04 21:22:13
Shinning123(金币+2): 2011-12-04 23:02:03
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zhang8826857(金币+4): 专家就是不一样啊…… 2011-12-04 21:22:13
Shinning123(金币+2): 2011-12-04 23:02:03
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纤维二糖水解酶？为何不先用含七叶苷的平板检测有没有活性？既然没有活性，为什么还纯化？没有活性的东西，纯化之后也是没有活性的。如果表达重组菌株在平板培养过程中不能使菌落及菌落附近变黑，那就是有问题，你的重组质粒转化之后有没有用平板筛选阳性转化子，不会是转化之后就直接液体培养，然后吭哧吭哧的纯化去了？ 测定酶活性的温度没有问题，05年我做过宏基因组文库，大肠杆菌培养和平板显色我都是用37度的，我筛选得到多个阳性克隆了。关于表达，我没有做这个酶，只是做了5个其它的纤维素酶基因，我觉得BL21(DE3)是没问题的，我唯一怀疑的就是基因在PCR的过程中突变了，可能是点突变，移码基本上不可能。  |
8楼2011-12-04 21:11:52
2楼2011-12-04 14:55:57
3楼2011-12-04 16:18:17
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zhang8826857(金币+2): good，鼓励热心虫子 2011-12-04 18:11:46
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zhang8826857(金币+2): good，鼓励热心虫子 2011-12-04 18:11:46
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1.原核表达出来的蛋白往往缺乏正确的折叠 没有糖基化 即使不是包涵体也很难会有活性 如果你相信是包涵体的问题 你可以用16度低温过夜表达 看看有没有活性 2.糖苷酶很多人表达都是用酵母的 3.关于测活 我记得是最后用碳酸钠或氢氧化钠等碱性物质终止反应 在碱性条件下pNP才显黄色 4. 你的酶英文名叫什么？beta-glucosidase?最适反映温度应该是40度以上 [ Last edited by MaoNaiJi on 2011-12-4 at 17:26 ] |
4楼2011-12-04 17:24:27
