| 查看: 4531 | 回复: 24 | |||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||||
[交流]
β-糖苷酶表达可溶性蛋白很多，怎么就是没有活性
|
|||||
| 最近表达几个β-糖苷酶基因（pet载体，BL21DE3），目的基因可溶性蛋白很多，也经过镍柱纯化了，蛋白电泳也跑了，都没什么问题，但就是在用pNP-G测活性时，都没活性，包括裂解全菌液，上清，纯化后的蛋白。酶活测定的条件是：醋酸钠缓冲液（ph 4, 4.5, 5, 7.0都试了）50ul+400ul水+15ulpNP-G +酶液。37度水浴几个小时也没反应。 大家指点下吧，是哪里有问题，谢谢了 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 生工检测理论与实务 |
» 猜你喜欢
药学硕士，第一、第二作者已发表6 篇 SCI，药理方向及相关方向2026年/2027年博士申请
已经有4人回复
-
26年博士申请自荐-电催化
已经有3人回复
-
中国地质大学（北京）博士招生补录，数理学院材料科学与工程专业和材料与化工专业
已经有6人回复
-
收到国自然专家邀请后几年才会有本子送过来评
已经有4人回复
-
考博
已经有5人回复
-
26年申博自荐-计算机视觉
已经有4人回复
-
药化及相关博士的申请
已经有3人回复
-
一篇MDPI论文改变了学习工作和生活
已经有4人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 测定β-半乳糖苷酶酶活为什么重复性差？？求高人指点
已经有17人回复
- 毕赤酵母表达的蛋白无活性
已经有8人回复
- 测定β-半乳糖苷酶活性用的质粒
已经有4人回复
- 【求助/交流】酵母表达可溶性蛋白问题
已经有12人回复
- 【求助/交流】组氨酸标记的蛋白表达活性问题
已经有17人回复
- 【求助/交流】诱导大肠杆菌产生β半乳糖苷酶要加多少乳糖
已经有4人回复
- 【求助/交流】老婆实验表达的真核蛋白没有活性，无比郁闷，祈求建议和祝福
已经有42人回复
- 【求助/交流】枯草中表达外源基因，有蛋白，但是没有酶活，是什么原因？
已经有4人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
工科男，工作稳定，希望能遇到有趣的她
+1/174
-
东南大学废弃碳资源利用团队（杰青/海优团队）博士后、科研助理及27级博士生招募
+1/130
-
湖南师范大学化学化工学院李斌课题组招收2026级博士生
+1/86
-
生命学部的面地青本子开始分发了么？
+1/64
-
西北工业大学物理科学与技术学院-诚聘【AI与光学交叉方向】博士后
+1/31
-
Google ai pro 会员分享
+1/29
-
南京邮电大学李巍教授招收2026博士生（5月12日前有效）
+1/20
-
香港理工大学汪志勋课题组招收2026年9月入学全奖博士生一名
+1/13
-
深圳理工大学-湖南大学项目招收钙钛矿方向博士生
+1/10
-
港科大广州 - 量子计算全额奖学金博士招聘（申请制，2026和2027均有名额）
+1/6
-
类器官/器官芯片 华西医院有编制研究员招聘
+1/6
-
浙江大学长江学者特聘教授黄飞鹤招聘博士后（年薪35万+）
+1/5
-
招收2026年秋季入学博士生1名（河北工业大学/北京科技大学联合 增材制造/生物材料）
+1/5
-
英国伦敦布鲁内尔大学高薪招聘欧盟玛丽居里全奖博士
+1/5
-
浙江大学长江学者特聘教授黄飞鹤招聘博士后（年薪35万+）
+1/4
-
QS百强名校招收“AI赋能固废低碳热转化”方向博士（免统考/直博友好）
+1/3
-
双一流高校南林化学工程学院-国家级青年人才团队招2026级博士（最后一波）
+1/3
-
Postdoc Position in SLAM & Spatial AI – University of Edinburgh
+1/2
-
2026年宁夏大学材料与新能源学院王海龙教授团队博士招生
+1/2
-
985院长团队！（大连理工，光电融合芯片方向） 招收2026秋入学博士生 5月初截止！
+1/1
冼亮淀粉酶
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +248 - MicEPI: 114
- 应助: 257 (大学生)
- 贵宾: 0.272
- 金币: 19558.9
- 帖子: 6605
- 在线: 2785.3小时
- 虫号: 856414
★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zhang8826857(金币+4): 专家就是不一样啊…… 2011-12-04 21:22:13
Shinning123(金币+2): 2011-12-04 23:02:03
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zhang8826857(金币+4): 专家就是不一样啊…… 2011-12-04 21:22:13
Shinning123(金币+2): 2011-12-04 23:02:03
|
纤维二糖水解酶？为何不先用含七叶苷的平板检测有没有活性？既然没有活性，为什么还纯化？没有活性的东西，纯化之后也是没有活性的。如果表达重组菌株在平板培养过程中不能使菌落及菌落附近变黑，那就是有问题，你的重组质粒转化之后有没有用平板筛选阳性转化子，不会是转化之后就直接液体培养，然后吭哧吭哧的纯化去了？ 测定酶活性的温度没有问题，05年我做过宏基因组文库，大肠杆菌培养和平板显色我都是用37度的，我筛选得到多个阳性克隆了。关于表达，我没有做这个酶，只是做了5个其它的纤维素酶基因，我觉得BL21(DE3)是没问题的，我唯一怀疑的就是基因在PCR的过程中突变了，可能是点突变，移码基本上不可能。  |
8楼2011-12-04 21:11:52
2楼2011-12-04 14:55:57
3楼2011-12-04 16:18:17
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zhang8826857(金币+2): good，鼓励热心虫子 2011-12-04 18:11:46
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zhang8826857(金币+2): good，鼓励热心虫子 2011-12-04 18:11:46
|
1.原核表达出来的蛋白往往缺乏正确的折叠 没有糖基化 即使不是包涵体也很难会有活性 如果你相信是包涵体的问题 你可以用16度低温过夜表达 看看有没有活性 2.糖苷酶很多人表达都是用酵母的 3.关于测活 我记得是最后用碳酸钠或氢氧化钠等碱性物质终止反应 在碱性条件下pNP才显黄色 4. 你的酶英文名叫什么？beta-glucosidase?最适反映温度应该是40度以上 [ Last edited by MaoNaiJi on 2011-12-4 at 17:26 ] |
4楼2011-12-04 17:24:27