应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » β-糖苷酶表达可溶性蛋白很多，怎么就是没有活性
51/1返回列表
查看: 4170  |  回复: 24
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

Shinning123

新虫 (初入文坛)

[交流] β-糖苷酶表达可溶性蛋白很多，怎么就是没有活性

最近表达几个β-糖苷酶基因（pet载体，BL21DE3），目的基因可溶性蛋白很多，也经过镍柱纯化了，蛋白电泳也跑了，都没什么问题，但就是在用pNP-G测活性时，都没活性，包括裂解全菌液，上清，纯化后的蛋白。酶活测定的条件是：醋酸钠缓冲液（ph 4, 4.5,  5,  7.0都试了）50ul+400ul水+15ulpNP-G +酶液。37度水浴几个小时也没反应。 大家指点下吧，是哪里有问题，谢谢了
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

生工检测理论与实务

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼2011-12-04 13:45:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

MaoNaiJi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking(金币+3): 鼓励发帖交流。 2011-12-04 18:54:06
Shinning123(金币+5): 2011-12-04 22:54:19
pNPG是邻（对）-硝基苯酚葡萄糖苷，被β-葡萄糖苷酶水解后生产pNP,
pNP在碱性条件下才显黄色！！ 显色之后才可以测吸光值，换算成酶活。
我以前就是做纤维素酶的，β-葡萄糖苷酶最适温度通常是40-50度，有的更高。另外 脂肪酶和这个有关么？无关吧！
关于表达，你可以尝试低温过夜表达，然后超声破碎沉淀，包涵体可以用尿素复活。详细的自己查资料了。
赞一下(4人) 回复此楼
7楼2011-12-04 18:31:41
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 25 个回答

MaoNaiJi

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
原核表达酶没有活性太正常了 你有毕赤酵母做就不一样了
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-12-04 14:55:57
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Shinning123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by MaoNaiJi at 2011-12-04 14:55:57:
原核表达酶没有活性太正常了 你有毕赤酵母做就不一样了

它没活性应该就是包涵体表达吧，那怎么会都是可溶性的蛋白呢，我有些怀疑是不是酶活测定条件有问题？
赞一下 回复此楼
3楼2011-12-04 16:18:17
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

MaoNaiJi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zhang8826857(金币+2): good，鼓励热心虫子 2011-12-04 18:11:46
引用回帖:
3楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-04 16:18:17:
它没活性应该就是包涵体表达吧，那怎么会都是可溶性的蛋白呢，我有些怀疑是不是酶活测定条件有问题？

1.原核表达出来的蛋白往往缺乏正确的折叠 没有糖基化 即使不是包涵体也很难会有活性 如果你相信是包涵体的问题 你可以用16度低温过夜表达 看看有没有活性
2.糖苷酶很多人表达都是用酵母的
3.关于测活 我记得是最后用碳酸钠或氢氧化钠等碱性物质终止反应
在碱性条件下pNP才显黄色
4. 你的酶英文名叫什么？beta-glucosidase?最适反映温度应该是40度以上

[ Last edited by MaoNaiJi on 2011-12-4 at 17:26 ]
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2011-12-04 17:24:27
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 25 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复(可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭