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Shinning123

新虫 (初入文坛)

[交流] β-糖苷酶表达可溶性蛋白很多，怎么就是没有活性

最近表达几个β-糖苷酶基因（pet载体，BL21DE3），目的基因可溶性蛋白很多，也经过镍柱纯化了，蛋白电泳也跑了，都没什么问题，但就是在用pNP-G测活性时，都没活性，包括裂解全菌液，上清，纯化后的蛋白。酶活测定的条件是：醋酸钠缓冲液（ph 4, 4.5,  5,  7.0都试了）50ul+400ul水+15ulpNP-G +酶液。37度水浴几个小时也没反应。 大家指点下吧，是哪里有问题，谢谢了
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1楼 2011-12-04 13:45:44
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MaoNaiJi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking(金币+3): 鼓励发帖交流。 2011-12-04 18:54:06
Shinning123(金币+5): 2011-12-04 22:54:19
pNPG是邻（对）-硝基苯酚葡萄糖苷，被β-葡萄糖苷酶水解后生产pNP,
pNP在碱性条件下才显黄色！！ 显色之后才可以测吸光值，换算成酶活。
我以前就是做纤维素酶的，β-葡萄糖苷酶最适温度通常是40-50度，有的更高。另外 脂肪酶和这个有关么？无关吧！
关于表达，你可以尝试低温过夜表达，然后超声破碎沉淀，包涵体可以用尿素复活。详细的自己查资料了。
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7楼2011-12-04 18:31:41
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MaoNaiJi

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
原核表达酶没有活性太正常了 你有毕赤酵母做就不一样了
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2楼2011-12-04 14:55:57
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Shinning123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by MaoNaiJi at 2011-12-04 14:55:57:
原核表达酶没有活性太正常了 你有毕赤酵母做就不一样了

它没活性应该就是包涵体表达吧，那怎么会都是可溶性的蛋白呢，我有些怀疑是不是酶活测定条件有问题？
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3楼2011-12-04 16:18:17
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MaoNaiJi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
zhang8826857(金币+2): good，鼓励热心虫子 2011-12-04 18:11:46
引用回帖:
3楼: Originally posted by Shinning123 at 2011-12-04 16:18:17:
它没活性应该就是包涵体表达吧，那怎么会都是可溶性的蛋白呢，我有些怀疑是不是酶活测定条件有问题？

1.原核表达出来的蛋白往往缺乏正确的折叠 没有糖基化 即使不是包涵体也很难会有活性 如果你相信是包涵体的问题 你可以用16度低温过夜表达 看看有没有活性
2.糖苷酶很多人表达都是用酵母的
3.关于测活 我记得是最后用碳酸钠或氢氧化钠等碱性物质终止反应
在碱性条件下pNP才显黄色
4. 你的酶英文名叫什么？beta-glucosidase?最适反映温度应该是40度以上

[ Last edited by MaoNaiJi on 2011-12-4 at 17:26 ]
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4楼2011-12-04 17:24:27
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