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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 纯化时蛋白一上柱就絮凝
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

[求助] 纯化时蛋白一上柱就絮凝

恼死了，用大肠杆菌表达系统表达了一蛋白，可溶，在上清中。可是纯化时，将蛋白一加到Ni2+柱中，马上就絮凝了，与填料一起结合成团状的东西。
起初蛋白浓度挺高，在4℃下和-20℃下过夜都会絮凝起来，后来将蛋白溶液稀释了5-8倍，保存时不会出现絮凝了，可是一上柱又出现了絮凝，真是搞不懂了！
请大侠们给我分析分析，究竟怎么回事？能不能再给我提点建议什么的，谢谢啦！
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1楼 2013-05-23 19:13:51
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by mitocam at 2013-05-24 11:33:50
TCEP还原能力更强，更稳定，而且不受金属离子催化氧化的影响，因为DTT或ME在有金属离子（如NI柱上的镍离子）存在的情况下，会很快被氧化失效的。

TCEP是否解决问题，决定于你蛋白质絮凝的根源，如果单单因为还原 ...

非常感谢。从电泳上看，HSP70应该不存在。或许是我的ME被氧化失效了， 我加了后在4℃下放了一段时间，现在都不怎么能闻到ME的那恶心的臭味了。再次感谢！
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13楼2013-05-24 12:18:24
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robustli

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aofeng860308(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-24 03:14:48
aofeng860308: 金币+1, ★有帮助, OK，Let me try，Thank you。 2013-05-24 10:25:18
try to add more NaCl salt into the buffer, load less sample to the column. Furthermore, adjust your PH to see if under different PH can maximize the protein's dissolvability.
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immunologyparasite
2楼2013-05-24 00:30:51
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
aofeng860308: 金币+1, ★有帮助 2013-05-24 10:25:30
1 可以加入0.5M nacl试试
2 看一下你的氨基酸组成，是否有独立的半胱氨酸，有的话要加dtt 的。否则就都氧化聚集而沉淀了。
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3楼2013-05-24 08:22:45
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-24 08:22:45
1 可以加入0.5M nacl试试
2 看一下你的氨基酸组成，是否有独立的半胱氨酸，有的话要加dtt 的。否则就都氧化聚集而沉淀了。

我的样品中是加有0.5M的NaCl的。这个蛋白的半胱氨酸确实较多，由于大多填料都不耐DTT，所以选择加了15mM的β-ME，可是还是有这个问题。
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4楼2013-05-24 10:18:36
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