应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白质的Ni柱纯化问题
51/1返回列表
查看: 3226  |  回复: 23
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

yaokuaile

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白质的Ni柱纯化问题

本人在做一个蛋白的Ni柱纯化，第一次的蛋白表达N端His，过Ni柱，因为不挂柱，所以进行了双His表达，但是，再次过Ni柱时情况很诡异，不同的咪唑梯度都能洗脱下来N多条带。用此Ni柱过其他蛋白时，也是可以洗脱掉N多条带，因此，想请教各位，请各位大虾帮帮忙啊，这种情况该怎么处理啊？！谢过了啊

20121106 Ni柱结果.jpg
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白质生物学实验经验 核酸生物学实验经验 技术

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-11-06 10:59:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yaokuaile

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by foryever at 2012-11-06 11:24:51
不挂柱不一定是His标签的问题，buffer的ph也会影响挂柱；另外不同浓度的咪唑洗下杂带应该是正常的吧，你只要关注在哪个浓度能只洗下你的目的蛋白就好了

首先，非常感谢您的热情回复。
目的蛋白的pI是4.06，我用的buffer pH为7.0.
用不同的咪唑梯度是可以洗下各种蛋白，但是，没有一个浓度是可以洗下单一的条带的，所以不解。。。
赞一下 回复此楼
4楼2012-11-06 12:06:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 24 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你没说明各泳道是什么样品，不好分析。
一般来说，样品上柱前用不含样品的缓冲液洗柱子减少非特异性吸附。杂带多可能是样品上柱后洗涤不够，增加洗涤时间和体积。把上柱前、flow through, wash, elute都留样跑胶。
赞一下 回复此楼
2楼2012-11-06 11:24:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

foryever

木虫 (文坛精英)

假装忧伤的枯木桩

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 正解 2012-11-06 11:32:18
不挂柱不一定是His标签的问题，buffer的ph也会影响挂柱；另外不同浓度的咪唑洗下杂带应该是正常的吧，你只要关注在哪个浓度能只洗下你的目的蛋白就好了
赞一下 回复此楼
　　　　　　　　　♨物是人非事事休，欲语泪先流♨
3楼2012-11-06 11:24:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yaokuaile

新虫 (初入文坛)
★
yqbter: 金币+1, 鼓励新虫发帖！ 2012-11-06 17:12:08
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-06 11:24:11
你没说明各泳道是什么样品，不好分析。
一般来说，样品上柱前用不含样品的缓冲液洗柱子减少非特异性吸附。杂带多可能是样品上柱后洗涤不够，增加洗涤时间和体积。把上柱前、flow through, wash, elute都留样跑胶。

首先，感谢您的回复。
样品顺序是：上清，流穿，buffer洗脱液，20，50,100,250,500,1000mM咪唑洗脱液，最后为沉淀。
对啊，我在上柱之前用20ml的buffer洗的，之后上样，过两次，所有样品都跑了SDS-PAGE。
怪异的是，我之前做的另一个蛋白，是可以用250mM咪唑洗脱下单一目的条带的，但是，前一次又过Ni柱，发现250mM洗下了好多条带。不解。。。
赞一下 回复此楼
5楼2012-11-06 12:12:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 24 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭