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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白质的Ni柱纯化问题
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yaokuaile

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白质的Ni柱纯化问题

本人在做一个蛋白的Ni柱纯化，第一次的蛋白表达N端His，过Ni柱，因为不挂柱，所以进行了双His表达，但是，再次过Ni柱时情况很诡异，不同的咪唑梯度都能洗脱下来N多条带。用此Ni柱过其他蛋白时，也是可以洗脱掉N多条带，因此，想请教各位，请各位大虾帮帮忙啊，这种情况该怎么处理啊？！谢过了啊

20121106 Ni柱结果.jpg
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1楼 2012-11-06 10:59:43
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yaokuaile

新虫 (初入文坛)
★
yqbter: 金币+1, 鼓励新虫发帖！ 2012-11-06 17:12:08
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-06 11:24:11
你没说明各泳道是什么样品，不好分析。
一般来说，样品上柱前用不含样品的缓冲液洗柱子减少非特异性吸附。杂带多可能是样品上柱后洗涤不够，增加洗涤时间和体积。把上柱前、flow through, wash, elute都留样跑胶。

首先，感谢您的回复。
样品顺序是：上清，流穿，buffer洗脱液，20，50,100,250,500,1000mM咪唑洗脱液，最后为沉淀。
对啊，我在上柱之前用20ml的buffer洗的，之后上样，过两次，所有样品都跑了SDS-PAGE。
怪异的是，我之前做的另一个蛋白，是可以用250mM咪唑洗脱下单一目的条带的，但是，前一次又过Ni柱，发现250mM洗下了好多条带。不解。。。
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5楼2012-11-06 12:12:00
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你没说明各泳道是什么样品，不好分析。
一般来说，样品上柱前用不含样品的缓冲液洗柱子减少非特异性吸附。杂带多可能是样品上柱后洗涤不够，增加洗涤时间和体积。把上柱前、flow through, wash, elute都留样跑胶。
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2楼2012-11-06 11:24:11
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foryever

木虫 (文坛精英)

假装忧伤的枯木桩

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 正解 2012-11-06 11:32:18
不挂柱不一定是His标签的问题，buffer的ph也会影响挂柱；另外不同浓度的咪唑洗下杂带应该是正常的吧，你只要关注在哪个浓度能只洗下你的目的蛋白就好了
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　　　　　　　　　♨物是人非事事休，欲语泪先流♨
3楼2012-11-06 11:24:51
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yaokuaile

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by foryever at 2012-11-06 11:24:51
不挂柱不一定是His标签的问题，buffer的ph也会影响挂柱；另外不同浓度的咪唑洗下杂带应该是正常的吧，你只要关注在哪个浓度能只洗下你的目的蛋白就好了

首先，非常感谢您的热情回复。
目的蛋白的pI是4.06，我用的buffer pH为7.0.
用不同的咪唑梯度是可以洗下各种蛋白，但是，没有一个浓度是可以洗下单一的条带的，所以不解。。。
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4楼2012-11-06 12:06:36
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