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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

而且,如果你减少上样入胶的蛋白,由于杂蛋白相对少了,那条带会以主蛋白为主;特别的,你可以在每个梯度洗就些,有时候会有几个梯度都洗出来蛋白,但是会有有最明显的那个梯度以目标蛋白为主
修身、齐家、治国、平天下
21楼2013-03-06 00:31:35
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一步一步

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

楼主的目的不就是His蛋白标签的纯化吗?
我想知道楼主目的蛋白的表达量大约是多少?
用Ni柱纯化效果不好,建议楼主使用免疫亲和层析柱料进行分离,现在市面上有售Anti-His affinity resin,能够特异性纯化His标签蛋白,这点是Ni-柱无法比拟的。
之前做过Ni柱和Anti-His affinity resin 纯化蛋白效果对比,Ni-柱纯化效果很杂,Anti-His affinity resin就能得到纯度在85%以上的目的蛋白。
建议楼主试试。
22楼2013-03-06 10:57:23
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你这个感觉表达就好些有问题!不管你那个浓度,都没有很明显符合你的目的蛋白的条带!
理论上表达得到的目的蛋白在总蛋白中的含量应该是很高的!
最好是确定一下你诱导表达前后的差异,你的目的蛋白是不是有大量表达!
杂质太多,可以考虑使用硫酸铵分布处理,用不同饱和度的硫酸铵处理,看你的目的蛋白在多少沉淀,优化好了,能够进行初纯后在上Ni柱,挂柱应该效果就好很多!
23楼2013-05-14 22:03:55
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yakir

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

初步看一下,你这符合目的条带大小的好像是在沉淀的样品中,根本就没提取出来呀,在没有大量His tag目的蛋白竞争Ni柱时,挂上这么多的杂蛋白还是挺正常的。每个梯度都能洗下来蛋白是你洗的柱体积太少。Ni柱重生的话,最好还是用100mMEDTA把Ni洗掉,然后用200mMNiSO4重新挂柱,当然前面的盐酸胍洗也是必要的。
还有你上的样品不全,最好再上个洗脱后的Ni柱样品,会有些蛋白沉淀在柱子上洗不下来的。
一步一步!
24楼2013-05-15 09:07:25
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