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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白质的Ni柱纯化问题
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

而且，如果你减少上样入胶的蛋白，由于杂蛋白相对少了，那条带会以主蛋白为主；特别的，你可以在每个梯度洗就些，有时候会有几个梯度都洗出来蛋白，但是会有有最明显的那个梯度以目标蛋白为主
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修身、齐家、治国、平天下
21楼2013-03-06 00:31:35
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一步一步

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

楼主的目的不就是His蛋白标签的纯化吗？
我想知道楼主目的蛋白的表达量大约是多少？
用Ni柱纯化效果不好，建议楼主使用免疫亲和层析柱料进行分离，现在市面上有售Anti-His affinity resin，能够特异性纯化His标签蛋白，这点是Ni-柱无法比拟的。
之前做过Ni柱和Anti-His affinity resin 纯化蛋白效果对比，Ni-柱纯化效果很杂，Anti-His affinity resin就能得到纯度在85%以上的目的蛋白。
建议楼主试试。
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22楼2013-03-06 10:57:23
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你这个感觉表达就好些有问题！不管你那个浓度，都没有很明显符合你的目的蛋白的条带！
理论上表达得到的目的蛋白在总蛋白中的含量应该是很高的！
最好是确定一下你诱导表达前后的差异，你的目的蛋白是不是有大量表达！
杂质太多，可以考虑使用硫酸铵分布处理，用不同饱和度的硫酸铵处理，看你的目的蛋白在多少沉淀，优化好了，能够进行初纯后在上Ni柱，挂柱应该效果就好很多！
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23楼2013-05-14 22:03:55
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yakir

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

初步看一下，你这符合目的条带大小的好像是在沉淀的样品中，根本就没提取出来呀，在没有大量His tag目的蛋白竞争Ni柱时，挂上这么多的杂蛋白还是挺正常的。每个梯度都能洗下来蛋白是你洗的柱体积太少。Ni柱重生的话，最好还是用100mMEDTA把Ni洗掉，然后用200mMNiSO4重新挂柱，当然前面的盐酸胍洗也是必要的。
还有你上的样品不全，最好再上个洗脱后的Ni柱样品，会有些蛋白沉淀在柱子上洗不下来的。
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一步一步！
24楼2013-05-15 09:07:25
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