10楼: Originally posted by yaokuaile at 2012-11-07 09:08:51
1.不算是新柱子了，我也用它过过另一个蛋白。用的也有十多次了
2.buffer不是按说明书配的，我要纯化这个蛋白做酶活
3.我设了六个梯度，从20到1000
O(∩_∩)O谢谢！~...

11楼: Originally posted by 加内特 at 2012-11-07 09:16:11
1.用了十次，应该也算是新的，GE柱可以用上百次的
2.buffer你按照说明书配，然后透析除盐、换缓冲液不行吗？
3.一般到500就行了吧，你这是什么柱子，还洗到1000,这么高，柱子可以承受得了吗？...

12楼: Originally posted by yongbo_liang at 2012-11-07 11:06:55
你的蛋白也挂柱，但挂柱后和杂蛋白分不开对吧？
如果你的介质使用了多次，且没有清洗过，建议你清洗后再使用。
还有你的样品目前纯化的缓冲液条件是什么样的？
你的目的蛋白纯化效果不好，和你蛋白中的His标签有 ...

9楼: Originally posted by yaokuaile at 2012-11-07 09:06:31
O(∩_∩)O谢谢。
目的蛋白分子量为21.9kD，marker分子量分别为97,66,44,29,20.4和14kD。我用了两个柱体积洗的，样品和buffer都没有加咪唑呢。...

16楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-07 14:31:15
洗两个柱体积肯定是不够的，一般要洗5-10柱。不按照说明配缓冲液也可以的，不过仍然需要一定的离子强度，最好含有5-10mM咪唑。此外如果不是新柱，可能有其他蛋白残留在柱上，最好完全清洗后重新装上Ni2+。...

17楼: Originally posted by yaokuaile at 2012-11-07 14:44:19
嗯，我也觉得可能是洗的太少了。我的柱子里，胶太多了，所以每次洗都要好久。。。我用的buffer是20mM Tris,100mM NaCl,10%甘油。离子强度应该差不多了吧，咪唑是一定要试试的。O(∩_∩)O谢谢...

18楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-07 14:48:33
这个缓冲液应该可以用，加一点咪唑，另外多洗洗。柱子大小可以根据你要纯化多少蛋白来决定，装大了费时间费药品不说，最后的洗脱下来的样品浓度还低。...

4楼: Originally posted by yaokuaile at 2012-11-06 12:06:36
首先，非常感谢您的热情回复。
目的蛋白的pI是4.06，我用的buffer pH为7.0.
用不同的咪唑梯度是可以洗下各种蛋白，但是，没有一个浓度是可以洗下单一的条带的，所以不解。。。...