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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白质的Ni柱纯化问题
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yaokuaile

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白质的Ni柱纯化问题

本人在做一个蛋白的Ni柱纯化，第一次的蛋白表达N端His，过Ni柱，因为不挂柱，所以进行了双His表达，但是，再次过Ni柱时情况很诡异，不同的咪唑梯度都能洗脱下来N多条带。用此Ni柱过其他蛋白时，也是可以洗脱掉N多条带，因此，想请教各位，请各位大虾帮帮忙啊，这种情况该怎么处理啊？！谢过了啊

20121106 Ni柱结果.jpg
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1楼 2012-11-06 10:59:43
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你这个感觉表达就好些有问题！不管你那个浓度，都没有很明显符合你的目的蛋白的条带！
理论上表达得到的目的蛋白在总蛋白中的含量应该是很高的！
最好是确定一下你诱导表达前后的差异，你的目的蛋白是不是有大量表达！
杂质太多，可以考虑使用硫酸铵分布处理，用不同饱和度的硫酸铵处理，看你的目的蛋白在多少沉淀，优化好了，能够进行初纯后在上Ni柱，挂柱应该效果就好很多！
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23楼2013-05-14 22:03:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你没说明各泳道是什么样品，不好分析。
一般来说，样品上柱前用不含样品的缓冲液洗柱子减少非特异性吸附。杂带多可能是样品上柱后洗涤不够，增加洗涤时间和体积。把上柱前、flow through, wash, elute都留样跑胶。
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2楼2012-11-06 11:24:11
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foryever

木虫 (文坛精英)

假装忧伤的枯木桩

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 正解 2012-11-06 11:32:18
不挂柱不一定是His标签的问题，buffer的ph也会影响挂柱；另外不同浓度的咪唑洗下杂带应该是正常的吧，你只要关注在哪个浓度能只洗下你的目的蛋白就好了
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　　　　　　　　　♨物是人非事事休，欲语泪先流♨
3楼2012-11-06 11:24:51
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yaokuaile

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by foryever at 2012-11-06 11:24:51
不挂柱不一定是His标签的问题，buffer的ph也会影响挂柱；另外不同浓度的咪唑洗下杂带应该是正常的吧，你只要关注在哪个浓度能只洗下你的目的蛋白就好了

首先，非常感谢您的热情回复。
目的蛋白的pI是4.06，我用的buffer pH为7.0.
用不同的咪唑梯度是可以洗下各种蛋白，但是，没有一个浓度是可以洗下单一的条带的，所以不解。。。
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4楼2012-11-06 12:06:36
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