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yaokuaile

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白质的Ni柱纯化问题

本人在做一个蛋白的Ni柱纯化,第一次的蛋白表达N端His,过Ni柱,因为不挂柱,所以进行了双His表达,但是,再次过Ni柱时情况很诡异,不同的咪唑梯度都能洗脱下来N多条带。用此Ni柱过其他蛋白时,也是可以洗脱掉N多条带,因此,想请教各位,请各位大虾帮帮忙啊,这种情况该怎么处理啊?!谢过了啊

20121106 Ni柱结果.jpg
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yaokuaile

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 加内特 at 2012-11-07 08:56:54
我做过很多次镍柱纯化,不下30次。我觉得
1.你这个是新柱子吗?新柱子结合力强,杂带多。
2.你的buffer是按照说明书上配的吗?GE预装柱的buffer是ph7.4的PB,加0.5mol/l的Nacl,离子浓度高,减少非特异性结合。一 ...

1.不算是新柱子了,我也用它过过另一个蛋白。用的也有十多次了
2.buffer不是按说明书配的,我要纯化这个蛋白做酶活
3.我设了六个梯度,从20到1000
O(∩_∩)O谢谢!~
10楼2012-11-07 09:08:51
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查看全部 24 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你没说明各泳道是什么样品,不好分析。
一般来说,样品上柱前用不含样品的缓冲液洗柱子减少非特异性吸附。杂带多可能是样品上柱后洗涤不够,增加洗涤时间和体积。把上柱前、flow through, wash, elute都留样跑胶。
2楼2012-11-06 11:24:11
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foryever

木虫 (文坛精英)

假装忧伤的枯木桩

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 正解 2012-11-06 11:32:18
不挂柱不一定是His标签的问题,buffer的ph也会影响挂柱;另外不同浓度的咪唑洗下杂带应该是正常的吧,你只要关注在哪个浓度能只洗下你的目的蛋白就好了
         ♨物是人非事事休,欲语泪先流♨
3楼2012-11-06 11:24:51
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yaokuaile

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by foryever at 2012-11-06 11:24:51
不挂柱不一定是His标签的问题,buffer的ph也会影响挂柱;另外不同浓度的咪唑洗下杂带应该是正常的吧,你只要关注在哪个浓度能只洗下你的目的蛋白就好了

首先,非常感谢您的热情回复。
目的蛋白的pI是4.06,我用的buffer pH为7.0.
用不同的咪唑梯度是可以洗下各种蛋白,但是,没有一个浓度是可以洗下单一的条带的,所以不解。。。
4楼2012-11-06 12:06:36
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