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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 含有咪唑的蛋白溶液用什么方法定量
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rinp

木虫 (正式写手)

[求助] 含有咪唑的蛋白溶液用什么方法定量

请问各位用含有咪唑的纯化蛋白溶液能否用Bradford法定量，如果不能应该用什么方法定量呢？
如果能明确详细解答，帮上忙就送上10个BB！！
多谢！！
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海到无边天做岸山登绝顶我为峰.博士学位就是鞋里的一粒米，不拿不舒服，拿了不能吃！
1楼 2012-09-27 20:19:54
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青豆同学

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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rinp: 金币+1, 谢谢回复，但是透析一般耗时很长啊而且蛋白损失严重，测280就是针对个别氨基酸的，非常之不准吧~~ 2012-09-28 10:24:40
透析后再定不可以么？梯度稀释后用分光光度计测280也行，但是要抠出背景值
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谢谢你给我信心与力量，我会努力！
2楼2012-09-27 21:33:06
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
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rinp: 金币+1, 谢谢回复！买试剂盒这个比较不现实~ 2012-09-28 10:26:36
有钱的话买个试剂盒。我用过biorad RC DC protein assay，还不错。简单的说是用TCA沉淀后重新溶解后就和普通蛋白样品一样定量了。
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3楼2012-09-28 06:42:24
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青豆同学

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

透析时，一小时换一次Buffer，3小时就可以，你体积应该不会很大，不需要多少时间
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4楼2012-09-28 12:26:29
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-28 06:42:24
有钱的话买个试剂盒。我用过biorad RC DC protein assay，还不错。简单的说是用TCA沉淀后重新溶解后就和普通蛋白样品一样定量了。

你的Bradford不是买的kit吗？你有没有离心超滤管，milipore YM-3的离心超滤管。用10倍无咪唑的的溶液洗三次可以把浓度降到很低，测试的背景小，基本没有干扰了。
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5楼2012-09-28 14:10:47
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protein780

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-09-29 14:44:58
可以用，吸光值不同，但是这样要求你的蛋白必须非常纯，因为所有的试剂盒的原理都是buffer跟蛋白反应，这样定量出来的是总蛋白包括降解蛋白，微量的杂蛋白，而且步骤相对麻烦些，我觉得简单有又比较可靠的是将标准的BSA稀释成1mg/ml，2mg/ml...然后跟你的蛋白一块跑SDS-PAGE，我觉得这是定量目标蛋白的相对靠谱的，当然，可以不用BSA，最好用跟你的蛋白大小差不多的已定量的蛋白做Marker，比如有的蛋白280吸收比较准。
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6楼2012-09-28 18:15:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-09-29 14:45:08
楼主大概是做的His-tag纯化吧。虽然不知道你洗脱液的咪唑浓度。反正一般的蛋白测定方法不能直接测，因为你直接测洗脱液就有很高的吸收。必须把咪唑浓度降下来。要简单的话，我觉得你做个丙酮沉淀或者甲醇沉淀什么的。
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7楼2012-09-29 09:54:21
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qianshengguo

铜虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-29 14:45:18
可以直接测。SDS电泳，将电泳图扫描或通过photoshop，数据分析计算得到累计密度，即蛋白溶度。用分光光度计测溶度偏差很大，尤其是咪唑、尿素等许多物质都对吸光值有影响，测得值一般偏大，有时候能偏差一倍（我自己曾经经历过）。
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8楼2012-09-29 09:58:50
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kukusnoopy

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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可以用Bradford法定量。595nm咪唑吸收可以忽略不计。但是咪唑在紫外会有吸收。
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9楼2012-09-29 14:56:50
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杜小康

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 青豆同学 at 2012-09-28 12:26:29
透析时，一小时换一次Buffer，3小时就可以，你体积应该不会很大，不需要多少时间

请问buffer用什么？蒸馏水可以吗

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10楼2017-09-13 17:00:50
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