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rinp

木虫 (正式写手)

[求助] 含有咪唑的蛋白溶液用什么方法定量

请问各位用含有咪唑的纯化蛋白溶液能否用Bradford法定量,如果不能应该用什么方法定量呢?
如果能明确详细解答,帮上忙就送上10个BB!!
多谢!!
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青豆同学

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
rinp: 金币+1, 谢谢回复,但是透析一般耗时很长啊而且蛋白损失严重,测280就是针对个别氨基酸的,非常之不准吧~~ 2012-09-28 10:24:40
透析后再定不可以么?梯度稀释后用分光光度计测280也行,但是要抠出背景值
谢谢你给我信心与力量,我会努力!
2楼2012-09-27 21:33:06
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
rinp: 金币+1, 谢谢回复!买试剂盒这个比较不现实~ 2012-09-28 10:26:36
有钱的话买个试剂盒。我用过biorad RC DC protein assay,还不错。简单的说是用TCA沉淀后重新溶解后就和普通蛋白样品一样定量了。
3楼2012-09-28 06:42:24
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青豆同学

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

透析时,一小时换一次Buffer,3小时就可以,你体积应该不会很大,不需要多少时间
谢谢你给我信心与力量,我会努力!
4楼2012-09-28 12:26:29
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-28 06:42:24
有钱的话买个试剂盒。我用过biorad RC DC protein assay,还不错。简单的说是用TCA沉淀后重新溶解后就和普通蛋白样品一样定量了。

你的Bradford不是买的kit吗?你有没有离心超滤管,milipore YM-3的离心超滤管。用10倍无咪唑的的溶液洗三次可以把浓度降到很低,测试的背景小,基本没有干扰了。
5楼2012-09-28 14:10:47
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protein780

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-09-29 14:44:58
可以用,吸光值不同,但是这样要求你的蛋白必须非常纯,因为所有的试剂盒的原理都是buffer跟蛋白反应,这样定量出来的是总蛋白包括降解蛋白,微量的杂蛋白,而且步骤相对麻烦些,我觉得简单有又比较可靠的是将标准的BSA稀释成1mg/ml,2mg/ml...然后跟你的蛋白一块跑SDS-PAGE,我觉得这是定量目标蛋白的相对靠谱的,当然,可以不用BSA,最好用跟你的蛋白大小差不多的已定量的蛋白做Marker,比如有的蛋白280吸收比较准。
6楼2012-09-28 18:15:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-09-29 14:45:08
楼主大概是做的His-tag纯化吧。虽然不知道你洗脱液的咪唑浓度。反正一般的蛋白测定方法不能直接测,因为你直接测洗脱液就有很高的吸收。必须把咪唑浓度降下来。要简单的话,我觉得你做个丙酮沉淀或者甲醇沉淀什么的。
7楼2012-09-29 09:54:21
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qianshengguo

铜虫 (小有名气)

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-29 14:45:18
可以直接测。SDS电泳,将电泳图扫描或通过photoshop,数据分析计算得到累计密度,即蛋白溶度。用分光光度计测溶度偏差很大,尤其是咪唑、尿素等许多物质都对吸光值有影响,测得值一般偏大,有时候能偏差一倍(我自己曾经经历过)。
8楼2012-09-29 09:58:50
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kukusnoopy

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以用Bradford法定量。595nm咪唑吸收可以忽略不计。但是咪唑在紫外会有吸收。
9楼2012-09-29 14:56:50
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杜小康

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 青豆同学 at 2012-09-28 12:26:29
透析时,一小时换一次Buffer,3小时就可以,你体积应该不会很大,不需要多少时间

请问buffer用什么?蒸馏水可以吗

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10楼2017-09-13 17:00:50
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