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vpz2007

木虫 (小有名气)

[求助] His-tag蛋白纯化柱子洗脱液中除去咪唑的办法

请问蛋白溶解在250mM咪唑、50mM磷酸二氢钠、300mM氯化钠中的蛋白洗脱液怎样才能除盐将蛋白改溶解在PBS中呢?
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可以接受失败,但不能失去再次站起来的勇气
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
vpz2007: 金币+2, 有帮助 2013-11-08 19:25:24
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-08 19:25:56
vpz2007: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2013-11-09 00:16:48
(1)透析
(2)浓缩样品后上分子筛柱,然后用你想要的溶液洗脱
行至水穷处,坐看云起时
2楼2013-11-08 16:27:13
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2013-11-08 19:26:02
vpz2007: 金币+1, 有帮助 2013-11-08 19:28:41
可以试试超滤,比透析快
3楼2013-11-08 16:30:15
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vpz2007

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2013-11-08 16:27:13
(1)透析
(2)浓缩样品后上分子筛柱,然后用你想要的溶液洗脱

透析的话用什么缓冲液透析呢?透析袋浸泡在哪里?我以前用PBS透析有蛋白在透析袋里面析出,好像是咪唑从透析袋出去之后PH变酸了。分子筛柱的话不是应该大蛋白先出来吗?是除盐啊,怎么换缓冲液呢?
可以接受失败,但不能失去再次站起来的勇气
4楼2013-11-08 19:25:12
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vpz2007

木虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wangpeng227 at 2013-11-08 16:30:15
可以试试超滤,比透析快

请问超滤的话咪唑和其他无机盐都是等体积滤出吗?那最后咪唑浓度也没有降低啊
可以接受失败,但不能失去再次站起来的勇气
5楼2013-11-08 19:28:16
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by vpz2007 at 2013-11-08 19:25:12
透析的话用什么缓冲液透析呢?透析袋浸泡在哪里?我以前用PBS透析有蛋白在透析袋里面析出,好像是咪唑从透析袋出去之后PH变酸了。分子筛柱的话不是应该大蛋白先出来吗?是除盐啊,怎么换缓冲液呢?...

稳妥的透析是逐步降低咪唑和盐浓度,到你希望的浓度为止

分子筛的小分子(水,盐,有机小分子,这些跟蛋白不是比大小的关系,不是一个数量级的)肯定先跑出来,如果够浓缩的话,换buffer一步到位,而且还可以进一步纯化蛋白
行至水穷处,坐看云起时
6楼2013-11-08 21:14:37
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vpz2007

木虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by pennchem at 2013-11-08 21:14:37
稳妥的透析是逐步降低咪唑和盐浓度,到你希望的浓度为止

分子筛的小分子(水,盐,有机小分子,这些跟蛋白不是比大小的关系,不是一个数量级的)肯定先跑出来,如果够浓缩的话,换buffer一步到位,而且还可以进一 ...

透析是说将250mM咪唑、50mM磷酸二氢钠、300mM氯化钠配成的洗脱液逐级降低当做透析袋外面的溶液吗?这样就可以?还是只降低咪唑浓度?

呃,弱弱的问一句,分子筛和除盐小柱一样吗?我们实验室以前有人用Thermo的Zeba脱盐离心柱除盐,那个可以吗,请问有用分子筛更换缓冲液的实验步骤吗?
可以接受失败,但不能失去再次站起来的勇气
7楼2013-11-09 00:16:00
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by vpz2007 at 2013-11-08 19:28:16
请问超滤的话咪唑和其他无机盐都是等体积滤出吗?那最后咪唑浓度也没有降低啊...

可以加上你要换的buffer,几次之后,buffer就被置换了,大分子的蛋白是被截留的,损失也有,但不太大。
8楼2013-11-09 12:26:18
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

引用回帖:
7楼: Originally posted by vpz2007 at 2013-11-09 00:16:00
透析是说将250mM咪唑、50mM磷酸二氢钠、300mM氯化钠配成的洗脱液逐级降低当做透析袋外面的溶液吗?这样就可以?还是只降低咪唑浓度?

呃,弱弱的问一句,分子筛和除盐小柱一样吗?我们实验室以前有人用Thermo的 ...

可以使用透析、超滤先除去不要的小分子,再加入需要的小分子,包括新的缓冲溶液,也可以使用分子筛更换缓冲液。

使用使用分子筛更换缓冲液的具体试验方法,请见:
吕宪禹 主编,蛋白质纯化实验方案与应用        ,化学工业出版社,2010,39-41,全书下载:http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6307126&fpage=1&target=blank
9楼2014-07-17 00:03:17
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