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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » FPLC蛋白纯化堵柱子？
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] FPLC蛋白纯化堵柱子？

使用FPLC纯化His-tag标记的重组蛋白时，1ml的GE的镍柱总被蛋白粗提液堵住，求解..
上样前处理操作步骤如下，
2L的Ecoli培养物，超声破碎，12,0000g离心1h，0.45um的膜过滤，滤液上HPLC。然后还会堵柱子。已重复两次，哪位大侠可以给个合理解释？
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1楼 2011-10-11 20:49:43
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
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3楼: Originally posted by wangds at 2011-10-11 14:38:39:
不知道你浓缩了多少体积的蛋白，是不是浓度太高？

1-2L的培养物，60mlbuffer破碎的...
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5楼2011-10-12 00:50:19
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
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4楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-10-11 16:39:25:
12,0000g离心1h是什么意思？12万倍的超级恐怖离心力！

呵呵，这个多了个0，谢谢指正...
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6楼2011-10-12 00:51:22
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
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7楼: Originally posted by violet.zhou at 2011-10-12 03:02:08:
没有脱盐吧

一般纯化结束后，再使用脱盐柱脱盐的...
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8楼2011-10-12 10:14:14
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
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9楼: Originally posted by chu_81 at 2011-10-12 03:24:32:
太粘了吧！
[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

确实是，使用重力柱纯化了下，flowthrough目的蛋白都很多...
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10楼2011-10-13 01:13:59
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
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11楼: Originally posted by enoch_lei at 2011-10-12 21:27:32:
您好！您说的堵柱子是指的是pressure升高了，还是柱子压根就不行了？如果你的蛋白不会precipitate的话（看flowthrough and fraction),那么就是样品太脏了，可以加点streptomycin然后换更高速的离心，稀释一点样品 ...

pressure到2MPa，柱子原则上应该可以吧，GE的那种1ml His tag 预装柱子.
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14楼2011-10-13 18:39:44
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
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15楼: Originally posted by lihuan0525 at 2011-10-14 02:44:24:
是不是浓度太高了，你可以先稀释一下，看看怎么样

放弃了，后来使用重力柱纯化，浓度还可以。
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16楼2011-10-14 15:24:20
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
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17楼: Originally posted by lpw106 at 2011-10-14 09:44:15:
上hplc柱的样品最好0.2μm过滤  可以保护柱子  也不容易堵

谢谢交流。超声破碎后，12000g离心30min。蛋白上FPLC前，一般使用0.45um的膜过滤。这些操作都比较规范执行了...
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18楼2011-10-15 05:25:47
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
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19楼: Originally posted by lhczj at 2011-10-17 09:03:59:
楼主遇到的问题基本上是属于原核表达系统的共性问题，具体原因很多，这也跟你的实验中加入物质及加入物质的浓度有关。原核表达破碎后离心可以去除一定的颗粒，但常常放置一段时间后还会有沉淀生成，所以建议在离心 ...

多谢哥们建议。加入就是常规的50mM tris 缓冲液，咪唑浓度20mM. 0.45um膜过滤后，放在4度冰箱，确实有沉淀出来...现在改用重力柱纯化了,效果也还凑合..
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20楼2011-10-19 01:07:02
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