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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » FPLC蛋白纯化堵柱子？
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] FPLC蛋白纯化堵柱子？

使用FPLC纯化His-tag标记的重组蛋白时，1ml的GE的镍柱总被蛋白粗提液堵住，求解..
上样前处理操作步骤如下，
2L的Ecoli培养物，超声破碎，12,0000g离心1h，0.45um的膜过滤，滤液上HPLC。然后还会堵柱子。已重复两次，哪位大侠可以给个合理解释？
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1楼 2011-10-11 20:49:43
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by lpw106 at 2011-10-14 09:44:15:
上hplc柱的样品最好0.2μm过滤  可以保护柱子  也不容易堵

谢谢交流。超声破碎后，12000g离心30min。蛋白上FPLC前，一般使用0.45um的膜过滤。这些操作都比较规范执行了...
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18楼2011-10-15 05:25:47
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quiller2000

木虫 (著名写手)
★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流！ 2011-10-11 21:51:18
克隆大虾(金币+2): tks,FPLC是专门用来纯化蛋白的，非HPLC.HPLC我们这一般用来分析或者制备化合物的... 2011-10-12 00:49:09
你这个不是HPLC吧，会不会是你的柱子颗粒太小了，这样给堵了啊！另外，你要看看是不是柱子太长时间不用了，长东西了；还有就是是不是温度太低，而buffer的盐离子浓度太高，有盐出来了，呵呵！
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2楼2011-10-11 21:32:10
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wangds

金虫 (正式写手)
不知道你浓缩了多少体积的蛋白，是不是浓度太高？
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3楼2011-10-11 21:38:39
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
12,0000g离心1h是什么意思？12万倍的超级恐怖离心力！
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4楼2011-10-11 23:39:25
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