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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 蛋白纯化遇到问题
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majunyang

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by 凡夫俗子 at 2012-01-02 09:37:30:
建议如下：
1. 将硫酸铵盐析得到的蛋白溶于缓冲液；
2. 取等量不同pH缓冲液，分别放入DEAE胶，将1.步骤中经透析后的蛋白加入到DEAE体系，混匀；
3. 测定每个体系中上清液的酶活，测到酶活最低的一组及可以吸附 ...

恩，谢谢，那盐析后溶于的缓冲液和加入到DEAE体系的缓冲液，pH要一样吗。
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11楼2012-01-04 09:30:43
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凡夫俗子

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

那个不要紧，毕竟蛋白的量要远小于每个试管中加入了DEAE的缓冲液的量
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12楼2012-01-04 16:34:06
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
不挂柱？看来你还是新手。我这半个月来网速慢不能上这里，今晚能上，但说不定什么时候就又不能上了，不能实时交流，所以你还是搜索所有我回复过的关于蛋白质纯化的帖子，看过之后你就明白了。不过要是你认为我傲慢就算了。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
13楼2012-01-05 00:51:47
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★ ★ ★
zhang8826857(金币+5): 鼓励应助 2012-01-06 08:41:19
无论是阴阳离子交换层析柱都要求目的蛋白质的pI与所使用的pH体系相差1个单位，但对于自己从没有纯化过的一个蛋白质来说，pI是未知的，如果用粗酶来测定pI又不够准确。其实没必要测定pI，只要做一个预备实验就可以知道应该使用什么样的pH值缓冲体系：如果有AKTA纯化仪，就使用一根CV=1ml 的层析柱（阴阳层析柱都要做这个预备实验）来吸附蛋白质，收集流穿，然后用1M氯化钠清洗层析柱并收集，这样的两个组分哪个含有你的酶，就知道起码要多少的pH值才能吸附你的酶了。

千万要注意用离子交换层析柱的样品所含盐浓度要低，盐析之后的沉淀含有盐，不能直接用离子交换层析柱来分离，最好是用G25脱盐柱来脱盐，最不济也要透析除盐。

7-56ms/cm是较低的电导，也有酶活说明是pH选择不当，不是样品里含盐多，如果是含盐多，则电导率会高。

在蛋白质能被牢牢吸附的情况下，3ml/min不算高，我使用CV=1ML的层析柱时也使用1ml/min，没问题。

分子筛的先决条件是目的蛋白质与杂质蛋白质分子量相差起码为1倍，但是蛋白酶分子量不会太小，绝大多数蛋白质都处于30-80KD之间，分不开的。
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14楼2012-01-06 08:29:51
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majunyang

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-01-06 08:29:51:
无论是阴阳离子交换层析柱都要求目的蛋白质的pI与所使用的pH体系相差1个单位，但对于自己从没有纯化过的一个蛋白质来说，pI是未知的，如果用粗酶来测定pI又不够准确。其实没必要测定pI，只要做一个预备实验就可以 ...

恩，应该是pH选择不当，我再提高pH一个单位试下。
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15楼2012-01-06 08:49:02
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majunyang

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-01-06 08:29:51:
无论是阴阳离子交换层析柱都要求目的蛋白质的pI与所使用的pH体系相差1个单位，但对于自己从没有纯化过的一个蛋白质来说，pI是未知的，如果用粗酶来测定pI又不够准确。其实没必要测定pI，只要做一个预备实验就可以 ...

另外，我把穿透峰和洗脱峰各组分有酶活的跑电泳，穿透峰里所有就能明显看出一个条带，洗脱峰里最大酶活的组分却在穿透峰的条带那没有条带，洗脱峰里有一个条带和酶活大小对应。那是不是有可能是两个同工酶啊


我洗脱体积为3个柱体积，洗脱峰未完全分开，是不是洗脱体积太少了？
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16楼2012-01-06 09:04:08
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
我喜欢洗脱20倍柱床体积，洗脱梯度为0-100%，不知道你这个3CV是怎样做的。

同工酶是有可能的
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
17楼2012-01-06 09:28:41
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majunyang

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-01-06 09:28:41:
我喜欢洗脱20倍柱床体积，洗脱梯度为0-100%，不知道你这个3CV是怎样做的。

同工酶是有可能的

我是用3倍柱体积，洗脱梯度0-100%，20个，好吧，我用的太太少了。
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18楼2012-01-06 09:38:03
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狐狸尾巴

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不挂阴离子柱就一定挂阳离子柱吗？
如果只有这两种选择的话，那研究出那么多柱子干嘛啊？
如果你的蛋白盐浓度很低，pH值也调整过，按照标准程序操作，但是最后IEX柱子都不挂，那就试试疏水或者亲和柱。发酵出来的蛋白质由于糖基化或者其他修饰的不均一性或者同工酶也可能导致分离纯化难度加大。
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19楼2012-03-15 15:15:07
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zonegirlcool

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你看到“淀粉酶”的帖子里的话了吗，有时候这就是个小问题，你把样品电导再调低上样试试，电导调到5以下试试，直接用你的平衡BUFFER稀释就行，一般能挂的都会挂上了。
梯度洗脱在摸条件时很有用，一般10-20CV，等你确定洗脱浓度以后就可以等度走了。
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20楼2012-03-15 16:07:13
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