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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白纯化分离问题
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tjutrevor

金虫 (正式写手)

[求助] 蛋白纯化分离问题

目前在做酶的分离纯化，报道的仅有4个相同功能的酶，但是比对后基本没有保守序列。。。
我做的菌也没有全基因组序列。。。
是不是只能一步一步纯化，直到SDS一条带？

实验时先过阴离子交换，后过分子筛，但是效果也不好。SDS的杂带较多，但是有一条带貌似是要找的。不知切胶做N端测序可不可以？引物如何设计呢？
还望请大牛们指点。谢谢了
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1楼 2011-06-02 17:41:08
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
你的是重组酶还是野生酶？
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2楼2011-06-02 18:41:20
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
silicare(金币+5, EPI+1): good 2011-06-03 18:16:54
tjutrevor(金币+20): 多谢！我是先硫氨沉淀的，不过没有脱盐 2011-06-05 14:38:30
1、        你的菌既然没有全基因测序，那么就不能设计引物来直接克隆。
2、        如果报道的仅有4个相同功能的酶，但是比对后基本没有保守序列，那就是说你的酶纯化出来之后可能会容易发文章。
3、        蛋白质纯化是需要一步一步来的，野生酶只要一步就能纯化就很夸张。
4、        为什么要先用离子交换层析柱？无论什么方法来培养的微生物，得到的酶，都会有很多杂质，包括细胞碎片和培养基成分等等，还有一些盐，这样的酶液要用离子交换层析柱就必须先去盐，而且有一些杂质还不一定能用0.22微米的滤膜过滤去掉，所以我认为第一步可以先用某种方法来初步纯化，例如硫酸铵沉淀和小分子有机溶剂沉淀，这样能去掉很多杂质，包括一些蛋白质杂质。假如是硫酸铵沉淀，那就可以立即用疏水层析柱，假如是有机溶剂沉淀，那么下一步可以去掉小分子有机溶剂，反正也要脱盐的，盐和小分子有机溶剂都可以被除掉。这样一来就更好了。
5、        凝胶过滤的效率是比较差的，不到不得已就别用，而且要求上样的样品体积要小，在缩小体积这一步说不定会损失蛋白质，说不定你的酶也有损失。
6、        既然条带很多，那就说明你要的那条带说不定也不纯，打质谱都可能打不出来，测序也一样可能测不出来，还是先纯一点再考虑切胶保险。
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4楼2011-06-03 01:12:15
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
silicare(金币+3): 鼓励交流 2011-06-03 18:18:05
我不建议第一步就是分子筛，理由是
1、分子量还不知道是多少，因为已经报道的基因没有同源性，不能依靠这个来估计自己的酶的同源性。当然如果能测定酶活力的话也不存在这个问题。
2、粗酶液里杂质较多，如果一下子把体积浓缩到很小，那么杂质会沉淀，会带动一部分酶也共沉淀，造成损失。
3、如果用离子交换层析，即使蛋白质太多，超出载量，那也是在穿透液中，可以再次过柱，蛋白质不会有任何损失。
4、N端的蛋白测序确实不用设计引物。
5、质谱和测序的问题，我是不建议立即做的，理由就是单条带也可能不纯，因为蛋白质太多，所以存在两个蛋白质跑到一起的隐患。
6、离子交换层析不只是阴离子交换，还有阳离子交换层析的，这就看蛋白质的等电点了。

楼上的猴子路飞怎么把草帽换了，那是梦想，不能换。
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6楼2011-06-03 15:56:19
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
疏水层析柱我们的是GE预装柱，用AKTA纯化仪，如果没有纯化仪，层析柜也可以，填料也可以买来自己装柱，不过效果肯定就没有用预装柱用纯化仪的好了。先做着吧。牌子问题也不用太注意，你问这个问题我是不是可以猜测你们实验室没有疏水层析柱，甚至连填料都还没有？没有贬低的意思，我们也是这两年才有的。

至于楼上说的切胶，我是一向不建议的，原因已经说过2次了。
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10楼2011-06-05 19:34:09
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
另外，离子交换层析的细节也可以说一下，包括样品处理，洗脱操作，什么样的pH，离子强度等，有时候细节会造成很大的影响。
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11楼2011-06-05 19:36:28
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
你这个酶有没有测定过在穿透液还是那个组分里？各有百分之几？

层析柱的柱床体积多少？

FPLC是可以接层析柱的，但是预装柱购买起来最最起码都要半个月，而且费钱还多，填料稍微便宜一些，就看课题经费怎么承担了，别自己买。FPLC的牌子不重要，有功能就行了，没坏就行

邮箱就不用留了，你把图片什么的发到论坛上来让大家看，集思广益。你用了“您”，好客气啊。
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13楼2011-06-05 22:19:25
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
都是5毫升的时候出来蛋白质，是因为柱床体积加上管道体积等于5毫升？

预装柱的还是自己用填料装的柱？

你还没说在各个组分里的酶活力分别占原始酶活力的百分比呢，结合图来看就有有趣的想法了。峰高不等于酶活力也高，只给图看不出来，A280也只是参考，酶活力才是标准。

为什么没有用连续线性洗脱，而是用不连续梯度？有没有起始液和洗脱液自动混合的设置？就是像AKTA那样，可以设定混合比例从0%-100%的。为什么选用了两个pH值？
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16楼2011-06-05 23:10:28
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
现在只有A280曲线，有没有测定电导率？如果有，就可以马上看出来洗脱梯度实际上是怎样的了，如果没有，就只能靠猜，虽说有点把握，但毕竟是猜。如果有，就跟A280曲线画在一起，弄个双Y轴。等下去做阳离子交换，可能后天做阴离子交换。Hitrap Q FF我们有两种柱床体积的。
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19楼2011-06-06 18:22:54
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