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wapw1987新虫 (小有名气)
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[求助]
gst标签蛋白的表达和纯化
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| 有没有高人做过GST标签的蛋白的表达和纯化，能不能给点建议，我用的是pGEX质粒，需要在什么菌株中表达，纯化时用什么方法收集提纯呢？ |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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xhjggl
木虫 (正式写手)
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3楼2011-12-24 21:17:50
Dionysius
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2楼2011-12-24 10:14:02
【答案】应助回帖
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wapw1987: 回帖置顶 2011-12-25 15:12:27
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linyingjia(金币+5, BioEPI+1, 专家考核): 很好 2011-12-27 20:30:24
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wapw1987: 回帖置顶 2011-12-25 15:12:27
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linyingjia(金币+5, BioEPI+1, 专家考核): 很好 2011-12-27 20:30:24
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1. 转8ml过夜小摇菌液接入800ml含氨苄的LB培养基（2L锥形瓶）, 37度摇菌至OD600至 0.6。 2. 诱导前取1ml菌液，也可使用转入其它质粒的未诱导的BI21菌株作对照。 这是没有诱导的对照，5000rpm，5min去上清，菌体用50 μl SDS loading buffer重悬，放置于－20度备用。 3. 加IPTG诱导蛋白表达，使其中浓度达0.1mM。 4. 室温诱导过夜（8小时左右），取1ml菌液。 这是诱导后的对照，5000rpm，5min去上清，菌体用100μl SDS loading buffer重悬，放置于－20度备用。 5. 使用冷冻离心机4000g，4度离心20分钟，去上清。（除去LB培养基） 6. 将-20度保存的菌体放在冰上15min，用lysis buffer重悬。（1g菌体用2到5ml lysis buffer） 7. 加溶菌酶，使其终浓度达1mg/ml，放置于冰上30min。 8. 超声破碎细胞（冰上进行），工作2s停1s，60s每循环，重复四次。 9. 10000g，4度离心30min。 11. 从上清中取出20μl，加5μl SDS loading buffer，放置于－20度备用。 Beads的预处理： 1） 将600μl 50％的Ni-NTA slurry/ Glutation Sepharose 4B加入层析柱，打开底部的的盖子，除去酒精。 2） 4ml 无菌水洗柱3－4次（间隔：4度 rotate10min） 3） Lysis buffer 洗柱2次（同上） 12. 将剩余裂解液加0.3ml beads，4度冰箱rotate 2hr。 13. 装柱 14. 用4ml Wash buffer洗beads（目的是洗掉非特异吸附），4度冰箱rotate 10min，重复洗四次，最后一次离心留少许上清。（因为有可能beads对融合蛋白的结合不强，所以每一步都保留上清） 每次洗脱都要取20 μl，加5μl 5*SDS loading buffer。放置于－20度备用。 15. 使用300μl Elution buffer洗柱（可根据情况，适量增加洗脱体积），4度冰箱rotate 10min，重复洗四次，每次都用一个EP管接收。分析每次洗脱的蛋白量，实验要在冰上进行。 每次洗脱都要取5μl，加5μl 2*SDS loading buffer，放置于－20度备用。 16. 10％SDS PAGE检测。 17. 检测蛋白浓度 |
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