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hwamg

银虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wapw1987: 回帖置顶 2011-12-25 15:12:27
wapw1987(金币+2): ★★★★★最佳答案 2011-12-25 15:31:24
linyingjia(金币+5, BioEPI+1, 专家考核): 很好 2011-12-27 20:30:24

1. 转8ml过夜小摇菌液接入800ml含氨苄的LB培养基（2L锥形瓶）, 37度摇菌至OD600至 0.6。
2. 诱导前取1ml菌液，也可使用转入其它质粒的未诱导的BI21菌株作对照。
这是没有诱导的对照，5000rpm，5min去上清，菌体用50 μl SDS loading buffer重悬，放置于－20度备用。
3. 加IPTG诱导蛋白表达，使其中浓度达0.1mM。
4. 室温诱导过夜（8小时左右），取1ml菌液。
这是诱导后的对照，5000rpm，5min去上清，菌体用100μl SDS loading buffer重悬，放置于－20度备用。
5. 使用冷冻离心机4000g，4度离心20分钟，去上清。（除去LB培养基）
6. 将-20度保存的菌体放在冰上15min，用lysis buffer重悬。（1g菌体用2到5ml lysis buffer）
7. 加溶菌酶，使其终浓度达1mg/ml，放置于冰上30min。
8. 超声破碎细胞（冰上进行），工作2s停1s，60s每循环，重复四次。
9. 10000g，4度离心30min。
11. 从上清中取出20μl，加5μl SDS loading buffer，放置于－20度备用。
Beads的预处理：
1）将600μl 50％的Ni-NTA slurry/ Glutation Sepharose 4B加入层析柱，打开底部的的盖子，除去酒精。
2） 4ml 无菌水洗柱3－4次（间隔：4度 rotate10min）
3） Lysis buffer 洗柱2次（同上）
12. 将剩余裂解液加0.3ml beads，4度冰箱rotate 2hr。
13. 装柱
14. 用4ml Wash buffer洗beads（目的是洗掉非特异吸附），4度冰箱rotate 10min，重复洗四次，最后一次离心留少许上清。（因为有可能beads对融合蛋白的结合不强，所以每一步都保留上清）
每次洗脱都要取20 μl，加5μl 5*SDS loading buffer。放置于－20度备用。
15. 使用300μl Elution buffer洗柱（可根据情况，适量增加洗脱体积），4度冰箱rotate 10min，重复洗四次，每次都用一个EP管接收。分析每次洗脱的蛋白量，实验要在冰上进行。
每次洗脱都要取5μl，加5μl 2*SDS loading buffer，放置于－20度备用。
16. 10％SDS PAGE检测。
17. 检测蛋白浓度

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4楼2011-12-25 01:02:41

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