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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组蛋白在BL21(DE3)中表达，存在包涵体
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

[求助] 重组蛋白在BL21(DE3)中表达，存在包涵体 已有3人参与

我的酶在大肠杆菌中表达后，刚开始表达酶活很高，SDS-PAGE显示蛋白在上清液中，后来某一天酶活突然下降，降到原始酶活的1/3左右，重新转化筛选仍没有效果，SDS-PAGE显示上清中的蛋白量减少了，而破碎后的沉淀中存在很多，这应该是以包涵体的形式存在吧？每次的发酵条件都一样，为什么刚开始没有而后来出现了呢？有什么解决方法吗？希望各位虫友不吝赐教
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1楼 2014-09-05 19:09:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

俗妮儿~

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-06 19:16:19
应该不是蛋白表达的问题，你确定每次发酵条件都一样？
看你的情况好像是蛋白产量太高，在菌体内大量积累就形成了包涵体。
干脆重新优化一下发酵条件吧，比如说温度时间什么的，再不行就试试分子伴侣质粒，这个东东有助于蛋白的折叠。
祝你实验顺利！
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4楼2014-09-06 12:19:35
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bolysu

禁虫 (著名写手)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-07 17:49:58
本帖内容被屏蔽
6楼2014-09-06 16:10:36
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liuxiuaza

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-01 12:25:42
引用回帖:
9楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2014-12-01 10:14:35
甘油管里的...

最好不要这样，我都是划线培养个板子，每次挑一个单克隆至5mL LB培养基中，先摇16个小时活化，然后拿活化的菌液接种，再诱导
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10楼2014-12-01 12:06:09
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普通回帖

小小cool

金虫 (正式写手)
菌种退化了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-09-05 20:54:14
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小小cool at 2014-09-05 20:54:14
菌种退化了

可是重新转过筛选过啊
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3楼2014-09-05 21:24:00
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 俗妮儿~ at 2014-09-06 12:19:35
应该不是蛋白表达的问题，你确定每次发酵条件都一样？
看你的情况好像是蛋白产量太高，在菌体内大量积累就形成了包涵体。
干脆重新优化一下发酵条件吧，比如说温度时间什么的，再不行就试试分子伴侣质粒，这个东东 ...

每次发酵条件都是一样的，接种OD值，IPTG浓度，诱导时间，温度，都控制的一样的，后来可溶性的蛋白就突然变少了，酶活也降低，发现都跑到沉淀里去了。
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5楼2014-09-06 14:56:51
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bolysu at 2014-09-06 16:10:36
质粒重新构建下，或者从DH5a菌种提原来的质粒重新导入表达菌，BL21有重组功能导致质粒不稳定

重新把DH5a提出来的质粒转到BL21中筛选过，感觉没有多大的效果。
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7楼2014-09-06 22:45:22
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liuxiuaza

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

想问一下，你接种的菌液是怎么来的？
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8楼2014-11-28 14:34:45
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by liuxiuaza at 2014-11-28 14:34:45
想问一下，你接种的菌液是怎么来的？

甘油管里的
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9楼2014-12-01 10:14:35
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